小动物医学分会论文选－－犬猫病毒病临床诊断技术研究进展

СＳⅤ

一、免疫胶体金技术在犬猫病毒病诊断中的应用
（一）免疫胶体金技术的基本原理
免疫胶体金技术的检测原理是以硝酸纤维膜为载体，包被已知抗原或抗体，加入待检样品后，样品中的抗体或抗原与膜上包被的抗原或抗体结合，再通过胶体金标记物与之反应形成红色的可见结果，从而达到检测目的。
试纸条上依次粘有A：吸水纸；B：玻璃纤维膜，膜上吸附着金标记物；C：硝酸纤维素膜（nitrocellulose membranes, NCM），根据需要在膜上包被不同的抗体（或抗原），并使其呈带状分布，作为检测线和质控线；D：吸收垫。ABCD首尾相连，当液体标本滴加在A上时，液体即向D处不断扩散，当液体到达B处时，金标记物被溶解，同时与标本中的抗原反应而形成复合物。液体继续前移至C处，金标记的复合物再与膜上检测线的抗体结合而呈现红色的线条，多余的金标抗体继续前移至D处。利用胶体金试纸检测的方式既可以标记抗体，又可以标记抗原；既可以采用标记抗原与待测抗原的竞争方式来检测抗体，又可以利用标记抗体或标记二抗的双抗体夹心法方式来检测抗原。
目前，该项技术已在医学上得到广泛的应用，大多数人的传染病都已经研制成免疫胶体金检测方法。在兽医诊断领域也已开始使用，如犬细小病毒、犬瘟热病毒临床快速诊断均已开始使用免疫胶体金快速诊断试纸条。

（二）免疫胶体金诊断技术的特点
1、免疫胶体金技术的优点
① 亲和性好（特异性好、灵敏度高），准确性高；② 稳定性好，批内/批间差小，易于质量控制；③ 示踪剂：已胶体金为指示剂，本身形成免疫分析过程后的颜色标记；④ 操作简便；⑤ 符号显示结果；⑥ 单体操作；⑦ 无需设备、仪器；⑧ 摆脱冷链，易运输、储藏；⑨ 自带质控对照；⑩ 经济实用。

2、免疫胶体金技术的缺点
① 灵敏度不如ELISA（仅相对于酶标而言，而酶有生物活性，故有第二批放大过程，使ELISA产品较金标法产品更为灵敏）；② 一般作为定性，不易定量；③ 若ELISA采用自动化分析仪时，大批量的集约性的操作，不如ELISA快而方便。
（三）免疫胶体金诊断技术在犬猫病毒病诊断中的应用
1、目前在我国兽医临床的应用情况
胶体金试纸条作为诊断试剂应用于兽医临床，由于它快速、准确，具有高度特异性和敏感性，结果直观可靠，而且试剂和样品用量极少，无需仪器设备，简化了繁琐的常规操作过程，同时也减少了因操作引起的误差。虽然在动物医学方面的研究起步较晚，但已经引起兽医界的重视，现在已有用于动物疫病检测的胶体金试纸条面市。如用于检测猪瘟抗体的免疫金标试纸条，检测鸡传染性法氏囊病病毒的免疫金标试纸条以及检测犬细小病毒、犬瘟热病毒的免疫金标试纸条等。可以预见在未来的兽医临床，免疫胶体金技术的应用一定会更加广泛。
2、犬细小病毒免疫金标试纸条的临床应用
（1）样品采集与制备
取病犬的粪便样品1g，加生理盐水5ml，充分摇匀后静置5分钟。
（2）操作方法
室温下将试纸条水平放置，取上清液3~5滴，逐滴缓慢滴入试纸条的加样孔（S）内，静置20~30分钟，观察结果。
（3）结果判定
阳性：试纸在C和T区位置出现两条平行的紫红色（或红色）线；
阴性：试纸只在C区位置出现一条紫红色（或红色）线；
无效：试纸不出现任何紫红色（或红色）线。
（4）注意事项
为确保检测结果准确，请严格按照说明书操作；试纸只能使用一次，请勿重复使用；试纸取出后应在15分钟内使用；包装袋子损坏或密封破损时，请勿使用此袋中的试纸；请勿将不同批号的试纸及其试剂混合使用。

二、ELISA技术在犬猫病毒病诊断中的应用
免疫测定（immunoassay，IA）是应用免疫学技术测定样品的方法。在临床诊断中主要通过抗原抗体反应检测体液中的抗原或抗体性物质。用酶标记物进行免疫学检测的方法称为酶免疫测定（enzyme immunoassay，EIA），是继放射免疫测定技术之后发展起来的一种免疫测定技术。EIA技术诞生于70年代初,以后被称为酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbentassay, ELISA）。
目前，该项技术已在兽医学上得到广泛的应用，大多数动物传染病都已经研制成ELISA检测方法，在犬猫病毒病诊断中也得到广泛应用。

（一）ELISA的基本原理
ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。在测定时，受检标本（测定其中的抗体或抗原）与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。

（二）ELISA诊断技术的特点
ELISA利用酶对底物的催化反应特性，将酶与抗体偶联并使之参与到抗原抗体反应中，依据酶催化底物所发生的变色反应程度，来指示和量化抗原抗体的反应水平。与普通的免疫沉淀、凝集实验和金颗粒、乳胶颗粒、同位素标记的检测技术相比，酶联免疫吸附试验有以下优点：
1、灵敏度高
由于该试验采用酶促反应，一分子的酶，可以催化多次反应，因此可以放大检测信号，提高检测的灵敏度。ELISA的反应模式基本上都是抗原/抗体/抗抗体-酶的方式进行的联级放大，大幅度提高了反应信号的强度。
2、特异性强
每一步反应都是抗原抗体的特异性识别过程，每一步都进行一次“纠偏”；通过控制酶联免疫吸附试验的溶液环境，可以去除非特异凝集、沉淀、非特异吸附作用的影响，增强反应体系的特异性。
3、方法快速、简便
ELSA的整个反应过程，一般不超过3小时。所用的试剂可以完全商品化，不需额外配制，操作简单，容易掌握。
4、重复性好
所用材料试剂系批量生产或制备，具有良好的均一性，无生物学实验中经常出现的个体差异现象。
5、自动化程度高，适合大批量标准化检测。
ELISA 检测过程，除了加入待测样品需要手工操作外，其它步骤均可用自动仪器来完成。在自动化条件下，平均每人每天可进行1000余份检测。检测过程易于自动化、标准化，受主观因素的影响较小，便于对检测工作进行质量控制。 6、安全
试验不需动用活毒，无散毒的危险。目前，国际粮农组织(FAO)和原子能机构(IAEA)已在世界各国推行和推荐该方法，以部分替代补体结合试验和血清中和试验。

（三）ELISA诊断技术在犬猫病毒病诊断中的应用
随着ELISA技术的不断发展和完善，在犬猫病毒性疾病诊断中发挥了重要的作用。经过几年的研究和实际应用，目前ELISA技术已经广泛用于犬猫病毒性疾病的诊断，先后建立了种犬猫病毒性疾病ELISA诊断方法。
三、PCR技术在犬猫病毒病诊断中的应用

聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction,PCR）,又称无细胞克隆技术（“free bacterin” cloning technique）,是一种对特定的DNA片段在体外进行快速扩增的新方法。该方法一改传统分子克隆技术的模式，不通过活细胞，操作简便，在数小时内可使几个拷贝的模板序列甚至一个DNA分子扩增107~109倍，大大提高了DNA获得率。目前已广泛应用到分子生物学研究的各个领域，在犬猫病毒病诊断中也得到广泛应用。

（一）PCR的基本原理
PCR是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，主要由高温变性、低温退火和适温延伸三个步骤反复的热循环构成。即在高温(95℃)下，待扩增的靶DNA双链受热变性成为两条单链DNA模板；而后在低温(37℃~55℃)情况下，两条人工合成的寡核苷酸引物与互补的单链DNA模板结合，形成部分双链；在Taq酶的最适温度下(72℃)，以引物3´端为合成的起点，以单核苷酸为原料，沿模板以5´~3´方向延伸，合成DNA新链。这样，每一双链DNA模板，经过一次解链、退火、延伸三个步骤的热循环后就成了两条双链DNA分子。如此反复进行，每一次循环所产生的DNA均能成为下一次循环的模板，每一次循环都使两条人工合成的引物间的DNA特异区段拷贝数扩增一倍，PCR产物得以2n的指数迅速扩大，经过25~30个循环后，理论上可使基因扩增109倍以上，实际上一般可达106~107倍。
假设扩增效率为“X”，循环数为“n”，则二者与扩增倍数“y”的关系式可表示为：y＝(1+x)n。扩增30个循环即n＝30时，若X＝100%，则y＝230＝1073741824（﹥109）；而若X＝80%时，则y＝1.830＝45517159.6（﹥107）。由此可见，其扩增的倍数是巨大的，将扩增产物进行电泳，经溴化乙锭染色，在紫外灯照射下（254nm）一般都可见到DNA的特异扩增区带。

（二）PCR诊断技术的特点
1、操作简便
目前，PCR技术采用耐高温的Taq DNA聚合酶，并且在有计算机控制的DNA扩增仪中进行，使操作大为简化，一次加入的酶即可满足反应全过程。DNA扩增仪能自动迅速升降温度，只需把反应所需的全部材料混匀，置入仪器内，反应便依所输入的正确程序进行。
2、省时
应用Taq DNA聚合酶时，单核苷酸掺入速率较高，75-80℃时，每个酶分子每秒钟可完成150个核苷酸的合成。PCR每一循环需数分钟，所以，一般常取用20-30个循环能使目的DNA达数百万倍扩增的反应只要1至2小时即可完成。在基因分离、突变体构建、DNA测序等方面，PCR方法均较之常规法快速得多。
3、灵敏度高
PCR产物的生成是以指数方式增加的，所以欲扩增pg量级的起始物到ug水平或放大真核细胞单拷贝基因，通过PCR方法都是不难完成的。PCR方法还可用单一双倍体细胞、一根头发、甚至单一精子进行DNA定型。
4、特异性强
作为引物的寡核苷酸与模板结合的正确性是决定反应产物是否特异的关键。Taq DNA聚合酶耐高温的性质使反应中引物与模板退火的步骤可以在较高的温度下进行，结合的特异性大大增加，被扩增的目的片段也能保持很高的正确程度。

5、对原始材料质量要求低
由于PCR技术有较高的灵敏度和特异性，故仅含微量（pg，ng）的目的DNA的粗制品或者总RNA，就可以用作反应起始材料来获取目的产物。部分降解的DNA材料也可以通过PCR多次反应循环，最终得到所需的全长DNA片段。
6、一定程度的单核苷酸错误掺入
由于Taq DNA聚合酶缺乏3´→5´核酸外切酶活性，因而不能纠正反应中发生的错误的核苷酸掺入，标准条件下，其错误掺入率可达1.25×10-4～1×10-5。但是，这种错误并不意味着PCR产物一定会发生序列改变。Innis M.A.发现，错误掺入的碱基有终止链延伸的作用倾向，这就使得发生了的错误不会再扩大。

（三）PCR诊断技术在犬猫病毒病诊断中的应用
在犬猫病毒性疾病预防中，注射疫苗是一项重要的措施，并在疫病防治中发挥了很大的作用。但不利的是为利用血清学检测方法诊断疫病带来了困难。检测出的抗体很难区别是疫苗免疫还是感染病毒产生的。因此，病原学检测的重要性越来越受到人们的重视。
随着PCR技术的不断发展和完善，在犬猫病毒性疾病诊断中发挥了重要的作用。经过几年的研究和实际应用，我国先后建立了14种犬猫病毒性疾病PCR诊断方法。
四、免疫酶组织化学技术在犬猫病毒病诊断中的应用

免疫组织化学（Immunohistochemistry）技术简称免疫组化技术，是组织化学的分支，其主要原理是用标记的抗体（或抗原）对细胞或组织内的相应抗原（或抗体）进行定性、定位或定量检测，经过组织化学的呈色反应之后，用显微镜、荧光显微镜或电子显微镜观察。凡是能作抗原、半抗原的物质，如蛋白质、多肽、核酸、酶、激素、磷脂、多糖、受体及病原体等都可用相应的特异性抗体在组织、细胞内用免疫组化手段检出和研究。

（一）免疫组化技术的基本原理
免疫组化技术是一种综合定性、定位和定量；形态、机能和代谢密切结合为一体的研究和检测技术。在原位检测出病原的同时，还能观察到组织病变与该病原的关系，确认受染细胞类型，从而有助于了解疾病的发病机理和病理过程。
免疫酶组化技术是通过共价键将酶连接在抗体上，制成酶标抗体，再借酶对底物的特异催化作用，生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，于普通显微镜或电镜下进行细胞表面及细胞内各种抗原成分的定位，根据酶标记的部位可将其分为直接法（一步法）、间接法（二步法）、桥联法（多步法）等，用于标记的抗体可以是用免疫动物制备的多克隆抗体或特异性单克隆抗体，最好是特异性强的高效价的单克隆抗体。直接法是将酶直接标记在第一抗体上，间接法是将酶标记在第二抗体上，检测组织细胞内的特定抗原物质。目前通常选用免疫酶组化间接染色法。

（二）免疫组化技术在犬猫病毒病诊断中的应用
免疫组化方法不仅可在脏器组织中特异地检出病原，又可发挥病理学检测直观、抗原定位准确的特点，如犬传染性肝炎病毒定位于细胞核内；犬瘟热病毒同时定位于胞质和胞核；狂犬病只定位在细胞质内等。通过免疫组化方法可明确观察到致病病原在组织培养细胞和机体细胞内的生长增殖动态，即病毒从宿主细胞到细胞，从一个部位到另一个部位的扩散过程。
免疫组化方法除可用于上述疫病的检测外，还可在脏器组织原位检测出病原的同时观察到组织病变与该病原的关系，确认受染细胞类型，从而有助于了解疫病的发病机理和病理过程。
随着免疫组化技术的不断发展和完善，在犬猫病毒性疾病诊断中发挥了重要的作用。经过几年的研究和实际应用，我国先后建立了8种犬猫病毒性疾病免疫组化诊断方法。[wmv=360,100,1]http://www.etc.edu.cn/blog/lulu/archives/go_home.mp3[/wmv]

周医生

:D专业支持!!!
我们诊断中心诊断禽流感\口蹄疫,等就是用PCR和ELISA等试验方法.
当然,门诊诊断犬瘟热和细小用的就是ELISA和胶体金等试验方法.