狗病研究摘抄

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双黄连治疗犬呼吸系统感染的疗效观察

犬的呼吸系统感染是临诊上常见病、多发病，常继发于犬瘟热，包括上呼吸道感染(病毒性，细菌性)扁桃体炎、急性支气管炎、慢性支气管炎及肺炎等，采用哈尔滨中药二厂生产的双黄连粉针剂治疗取得一定疗效，报告如下。

1　资料与方法

1.1　临诊资料　829例病犬中，呼吸系统感染有512例，2～6月龄犬有296例，成年犬有206例，其中上感325例，急性支气管炎131例，急性扁桃体炎12例，肺炎44例。

1.2　方法　所有病犬均详细记录治疗前后症状、体征及饮食情况，经确诊后，按60 mg/kg体重用5%葡萄糖稀释静注或注射用水稀释肌注，治疗期间配合一定的抗生素效果较好。

2　临诊疗效评定标准　　治愈：3天内体温正常，症状消失，1周内咳嗽、脓性分泌物、扁桃体肿大等症状消失，肺部罗音消失，食欲正常。显效：3天内体温降为正常，症状减轻，仍然有咳嗽，呼吸音粗厉。无效：3天内体温仍然保持39.5℃以上，肺部湿罗音无明显减轻。

3　结果　　双黄连粉针剂治疗犬上感和急性扁桃体炎等病，一般退热时间在24～48 h，咽炎、咳嗽等症状消除时间一般在48～72 h，作用较快，有效率达92%，治疗情况见表1、表2。

表1　512例患犬临床疗效评定

表2　各种临床疗效比较

4　讨论

双黄连粉针剂是一种抗菌、抗病毒中药制剂，它由金银花、连翘和黄芩精制而成，3种中药均有清热解毒作用，金银花主要用于外感表面热症；连翘对于发热、咽喉肿痛有效；黄芩用于肺热咳嗽。现代研究表明：金银花含有皂素、鞣质、纤维糖等，有广谱抗菌作用；黄芩有广谱抗菌、抗病毒作用，有效率达92%，配以一定抗生素联合用药，对犬的呼吸系统感染或混合感染效果更明显，且无明显副作用，是犬呼吸系统感染中常选的药物。

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北京犬接种五联苗过敏1例

上午10：00左右，该犬接受犬五联苗首次免疫，操作按正常免疫途径进行。中午约1：00，畜主急携犬反映，半小时前犬口角开始流涎，涎液呈线状不断、量多，并作逆呕表现。当即予以注射阿托品0.4 mL，再口服阿托品0.2 mL，观察15 min后见犬停止流涎，且活动正常，故让其返家观察。

下午3：00，畜主再次匆忙携犬反映，10 min前犬开始步态不稳，气急，对呼唤无反应。临诊体温升高，眼睑水肿，眼球被遮盖至正常时的一半左右，听诊肺有湿罗音。笔者赶紧给犬皮下注射0.1%肾上腺素0.5 mL，同时静注氢化可的松40 mg，山茛菪碱2 mL(10 mg)，20 min后犬逐渐恢复。对外界反应敏感，眼睑睁开，30 min后听诊肺罗音消失，表现正常。

犬接种疫苗发生过敏的事例较为少见，自我站宠物医院开办5年来，在接受免疫预防的近2 000只犬中尚属首次。且临床表现特殊，一是过敏出现时间较迟，二是未出现一般过敏所表现的前爪搔抓面部、挣扎等症状。我们体会到，对过敏动物除采用强心、激素脱敏外，还应针对性缓解过敏性肺高血压所致的肺水肿症状。临床中选用山茛菪碱较为理想，可解除平滑肌痉挛，扩张微血管，降低血管通透性，从而改善微循环，还可抑制肾上腺素诱发的心悸、震颤等不良反应。此外因该品系植物中提取，使用剂量的安全范围相对较宽，剂量为每千克体重0.2～2.5 mg。

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犬瘟热免疫失败的原因及对策

犬瘟热(Canine DistemPer.CD)是由犬瘟热病毒引起的主要危害幼犬的传染性极强的传染病，由于发病率高，死亡率高，给养犬者带来严重损失。长期以来，人们在治疗犬瘟热上进行了很多努力，但收效甚微。目前，接种疫苗预防犬瘟热已是众望所归，但由于种种原因，仍有许多免疫过的犬只发病。笔者在从事动物防疫和犬病诊疗过程中，查阅了大量文献，分析免疫失败的原因，采取了一些不成熟的办法，现予报告，与同行共商。

一、犬瘟热免疫失败的原因

在笔者诊治的43条犬瘟热病犬中，有28条接种过1次犬六联苗，有6条接种过2次五联苗，2条接种过3次五联苗，3条接种过一次二联苗，其余未接种过疫苗。

1．疫苗质量不过关。犬瘟热对犬的危害性，其他疾病与之根本不能相提并论。但截止目前，笔者未见到专用预防大瘟热的疫苗，市场上普遍使用的是二联、三联、五联和六联苗。业内人士多数认为，苗联的越多，免疫效果越差。笔者呼吁有关部门尽快研制出专用犬瘟热免疫用品。

2．首免时间难以确定。待免疫幼犬来源各异，母犬免疫状况不明，幼犬母源抗体难以测定。笔者曾遇到过35日龄首免，13天后发病的病例。因此，从某种意义上讲，新购入犬在母体免疫情况不明的情况下，何时首免似乎都没有保证，特别是使用联苗1头份更难以保证免疫效果。

3．血清或免疫球蛋白使用混乱。目前，许多诊所一接到病例，无论动物大小，无论什么病，第一件事就是注射血清。许多文献记载，免疫血清不能终断犬瘟热病情。如果犬只确实感染了免疫血清所能防治的几种传染病，早期使用或许能起到一定作用，但是幼犬大多都是由于饲养不当，刚刚断乳不适应喂食或喂的过多、过勤，洗澡过勤以及喂给或误食了不应喂的食品而引发的疾病。这样，如果给动物注射血清或免疫球蛋白，是必影响犬瘟热的主动免疫，而这种免疫血清能否抵抗犬瘟热强毒还值得怀疑。

4．免疫剂量不足。一些养犬者为了防止发生犬瘟热，纷纷到熟人家购买幼犬，认为这样很有把握，但也有一些犬只发生犬瘟热。笔者认为，首免剂量不足，是首免后发生犬瘟热的主要原因，由于剂量不足，大部分疫苗被母源抗体中和，首免不起作用。

5．疫苗接种途径不当。许多兽医工作者为了避免注苗时犬只疼痛、狂燥不安，迎合犬主人心理，采用皮下注射接种，这样虽然既方便又迅速，但免疫效果最不好。

6．免疫次数不足。门诊记录揭示，66％的犬只进行过一次免疫，9.4％犬接种过两次。0.8％的犬接种过三次，其余都未接种过疫苗。犬瘟热的发病率与接种疫苗次数呈反相相关。

二、对策

为切实做好犬瘟热的防制，笔者在从事门诊诊疗过程中采取了以下措施。

1．采用正规厂家生产的疫苗，尽量使用联数少的。犬瘟热一细小病毒二联苗从感观上比五联、六联苗有效的多(尚未进行完全统计)笔者曾用人用麻疹疫苗对7只未断奶犬和4只断奶犬进行首免，免疫剂量为1.5-2头份，20天后用犬用五联苗二免，二免后3个月用五联苗三免，至今已6—7月龄，未发生犬瘟热。

2．美国兽医学会曾建议，免疫状态不明的3月龄以下犬只应给两剂或三剂以上疫苗。我们应对断奶犬用二联或五联苗首免，免疫剂量2-3头份，隔3周后二免，12-16周时三免，剂量为1头份或2头份。以后每年接种一次五联疫苗。

3．改变接种途径

文献记载，静脉或肌肉注射疫苗免疫产生快、效果好，皮下接种免疫产生慢且不确实。因此，我们普遍采取肌肉接种方法。

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狂犬病防制工作的几点建议

狂犬病是一种人兽共患的自然疫源性疾病，犬和多种野生动物是本病的储存宿主，是人类感染的主要传染源。我国政府对狂犬病的防制一直很重视，在各个时期就制订出了有关的法规和条例，并多次召开全国性的行政会议、学术会议并派员参加国际间学术交流，这对我国狂犬病的防制工作起到了重要的指导和推动作用。但在执行过程中，往往由于对防制工作的整体战略发展缺乏预见性、对防制措施的片面理解、对狂犬病的流行病学缺乏全面了解和对防制工作的持久性和连续性认识不足，因此，多年来疫情出现反复，防制效果不甚明显，有些地区人兽间狂犬病的流行仍较严重。随着近年来对狂犬病科研工作的进展，防制经验的总结和积累，对狂犬病防制的认识有了提高。现就狂犬病防制中的几个问题，谈几点意见。

1　狂犬病的流行特点

1.1　传染源众多，分布广泛，带毒、排毒时间长　现已查明，除犬外，家畜中的猫、野生动物中的狐、狼、豺、浣熊以及美洲和非洲的吸血蝙蝠等都是重要的传染源。在一些已消灭了家畜间狂犬病的国家(如美、英、日、加等)，狂犬病的传染源已由家畜“易位”于野生动物。如美国1951～1980年30年间的动物检疫结果表明，犬狂犬病的抗体阳性率由45%降至13%，而野生动物的阳性率由21%上升至73%。这种传染源的“易位”是带有普遍性的。我国是否也已出现“易位”现象，虽未见有关资料的报道，但被野生动物咬伤所致的人、畜狂犬病病例，已日渐增多。如四川省1984～1994的10年间调查统计，伤人的动物共有6种，其中犬伤占98.76%，其次为猫，而野生动物如鼠、狐、獾、水獭等4种动物占1.24%。其它如黑龙江、新疆、湖北等省也都相继报道了由疯狼、熊、野猪等咬伤所致人、牛、骆驼、羊、猪等动物狂犬病的病例。由此可见，本病的传染源正在扩大。这种传染源的多样化，给本病的防制工作提出了新的课题和增加了难度。

1.2　传播途径多　以往认为咬伤感染是本病唯一的感染途径。现已查明，本病还可通过带毒犬、猫的舔、接触伤口或粘膜而感染，人和动物还可通过气溶胶经呼吸道感染。另据山东、河南等省的报道，当地犊牛发生的狂犬病均无犬、猫咬伤史，其传播途径又是什么?这都是值得进一步查明的问题。

1.3　流行规律复杂　如我国野生动物的感染率的高低及在本病的发生发展中起到多大作用?传播途径除咬伤外，还有哪些?犬咬伤与临床发病的关系?“健康犬”、猫的带毒率有多高?家畜和野生动物的预防免疫的和疫苗的改进提高等问题都未作细致的调查和研究。某些流行特点和规律仍不清楚。因而防制措施的针对性较差，防制效果也不明显。

普遍认为存在有“健康犬”带毒。如储菊仁曾统计909例狂犬病死亡者生前被外观正常犬咬伤者占17.82%。广东罗会明等于1990～1991年间对1 258只“健康犬”用荧光抗体法作脑带毒率调查，结果其带毒率为10.81%～30%，平均为17.93%。

2　国外预防、控制狂犬病的主要措施

2.1　对家犬大面积的预防免疫是控制和消灭狂犬病的根本　80多个本病流行国家的调查显示，在人狂犬病病例中有98%以上是由犬传播的。因此，预防人的狂犬病，除对人进行有效的预防接种外，必须对犬和野生动物实行全面的综合性预防措施。在一些养犬较多的国家里，对动物大面积、强制性的疫苗接种以控制狂犬病，已取得预期效果。如美国1940年发病数为5000例以上，1965年不到10例，近几年仅个别病例发生，当前已把控制狂犬病的重点放在野生动物的免疫接种上。秘鲁的利马、卡劳两城市是狂犬病连年猛增的城市。他们组织人力在短期内对犬27.3万只，猫的免疫率达75%，免疫后36个月仍有54%的犬血清中和抗体效价＞1.0IU/ml，疫苗接种后3年2个月内再没有人、畜狂犬病例的发生。 2.2　不断改进人、畜狂犬疫苗的质量，改进免疫程序，提高疫苗的免疫效果　人用疫苗已由动物组织苗→细胞培养苗→浓缩纯化苗→处于研究阶段的亚单位苗或合成疫苗及基因重组苗。在免疫方法上由皮下注射14～21针(每针2ml)→5针(每针0.5～1ml)→皮内多点免疫(多针，每针0.1～0.2ml)；及由暴露后免疫→暴露前预防免疫。

动物用疫苗由羊脑灭活苗→BHK21乳地鼠肾细胞灭活苗→基因重组苗。在免疫方法上由皮下注射→口服免疫。 2.3　在消灭家犬间狂犬病的情况下，目前的防制重点已转移至对野生动物的免疫。目前尚无资料可证明灭犬可控制狂犬病的传播。只有加强对家犬和野生动物的免疫才是预防人畜间狂犬病的有力措施。因此，即使在消灭了人畜间狂犬病的今天，他们仍投入大量人力物力，采用空投疫苗诱饵以预防野生动物狂犬病，并已取得明显的防疫效果。某些欧洲国家采取上述措施后，1994年的发病率已降至1989年的20%以下，现欧美许多国家都已开始行动。

3　国内预防控制狂犬病的主要措施

我国政府和有关部门制订的有关法规、通知，对预防和控制狂犬病起到了指导和推动作用，但在具体执行中，往往把“管、免、灭”的综合防制措施片面理解、执行为“禁养、限养和捕杀家犬”的措施。结果，国家提出的奋斗目标未能完全实现，有的省(市)的疫情反而有上升趋势。据国内某专家的统计，在1949～1969年内全国总发病数不足1000例，而1970年1979年每年的病例为1000～4000例，1980年后的10年间，每年为5000～8000病例。又据1989年7月在烟台召开的“全国狂犬病免疫学术讨论会”的会议纪要中提到：“近年来，我国狂犬病呈急剧上升趋势，1987年山东省上升4.5倍，黑龙江上升80%，湖北、福建、贵州、江西、河北、广西等省(区)上升约20%以上，病死率100%，居各种传染病之首位。但国内有些省(区)在深入流行病学调查的基础上，把防制工作重点放在大面积的家犬免疫接种后，狂犬病的发病率明显降低，取得了很好的防疫效果。如四川省自1984年始，将“禁养区”改为“限养区”，加强对限养区犬只的管理，实施以犬只免疫为主的“管、免、灭”综合防制策略，犬只免疫率连年达75%以上，从而1994年的狂犬病发病率比1984年降低了105倍，防制效果卓著。其它如吉林、河南、广东、青岛、广西玉林等省(市)都采用大面积家犬免疫接种后，狂犬病的发病率都有明显下降。

4　对我国狂犬病防制工作的几点建议

4.1　要组织人医、兽医部门的科技人员进行全国性的流行病学调查，特别是广大农村中狂犬病的流行规律、流行特点应作进一步调查，如传染源的种类、野生动物在传播中的作用，“健康犬”的带毒程度和在疫病流行中的作用，传播途径等，作为制订防制措施的依据。

4.2　组织国内各方面的技术力量，开展狂犬病疫苗的研究，以达到免疫剂量小、产生中和抗体迅速、接种反应轻微或无、免疫期长和价廉的要求。目前人用地鼠肾狂犬病疫苗尚有一定程度的副反应，应研制纯化的新一代疫苗。在动物用疫苗方面，尤其是口服苗，应组织力量，加强研究，在取得部分实验研究成果的基础上，应进一步扩大试验，推广使用，这对预防和控制狂犬病具有重要的意义。另外，应在疫苗诱饵、投放方式、免疫效果等方面进行研究，为预防野生动物狂犬病打下基础。

4.3　加强对犬的管理。据临床-流行病学调查证明，目前城市发生的人狂犬病，约有98%的病便与被犬咬伤有关。因此，必须加强对犬的管理。怎样管理才能有效地预防和控制狂犬呢?事实证明，犬作为一个生物种从1万多年前留存下来，并被驯化成家畜之一，说明它对人类对社会都是有用的，灭犬既违背了生物间的生态平衡，而且也是杀不尽的，更不能以此来预防狂犬病。相反。国内外的很多资料足已证明，只要持之以恒地使用有效的狂犬疫苗，使其免疫覆盖率连续数年达到75%以上时，就可有效地控制狂犬病的发生。管犬，还要健全犬只登记、立册制度，实行强制性免疫接种，除每年的定期免疫外，对以后长大的幼犬和新增犬的补免和捕杀不免犬和野犬，及时做好疫情监测、疫情报告、加强进口犬的检疫等，都是很重要的犬只管理工作。

4.4　做好宣传教育，提高广大群众、医务人员对狂犬病的正确认识，增强免疫接种信念，树立狂犬病可以预防和消灭的信心。

4.5　从中央到地方各有关部门成立各级专门组织——狂犬病防制办公室，统一领导和指挥，制订狂犬病法制、法规，各级主管部门必须把防制工作列为经常性的工作，坚持不懈地抓，掌握疫情和流行病学资料，保证疫苗的质量和供应，切实把防制工作落到实处。

作者单位：解放军农牧大学兽医学院朱维正

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犬的呼吸道传染病

本文就犬的直接接触性呼吸道传染性，特别是关于支气管败血液波氏杆菌、支原体、犬疱疹病毒、犬副流感病毒和呼肠病毒等病原所致的传染病，在临床表现、针对和防治等方面作了描述。

犬的呼吸道传染病在临床上发病率很高，其致病因素也很多。从临床微生物学和传染病学的角度看，可以分为特异性和非特异性两种。关于犬呼吸道的非特异性感染，作者已作过综述。本文就直接接触传染的犬呼吸道传染病，根据作者实践，参考国外文献予以论述，旨在为综合防治犬呼吸道疾病提供资料。

病因学

已经证明，舍饲犬的犬舍、饲料、管理水平、品种、年龄以及环境、气候、应激等因素都可作为犬呼吸道的诱因。更重要的是一些特异性病原体，现已知道主要是犬瘟热病毒（Canine distemper virus, CDV ）、犬腺病毒（Canine adenovirus,CAV）、犬副流感病毒（Canine parainfluenza virus ,CPIV）、呼肠病毒（Reovirus）、犬疱疹病毒（Canine herpesvirus，CHV）以及支气管败血波氏杆菌（Bordetekka bronchiseptica）等。

研究表明，犬瘟热是严重呼吸道传染病最常见的病因。就呼吸道传染病而言，无犬瘟热病毒抗体的犬和有抗体的犬相比，发病率明显增高；未经犬瘟热防疫的犬比防疫过的犬发病率高、病情重、病程长、致死率高。关于犬瘟热冰冻引起的呼吸道传染性，资料较多，本文不另赘述。

在犬病临床上，一些病原体可以单独也可以结合在一起导致犬呼吸道传染病的暴发，主要表现为气管支气管炎，或窝咳（Kennel cough）。环境和一些应激因素则起促进感染发生和加重疾病严重程度的作用。

较早期的研究主要是一些细菌感染。其中，最常见的有支气管败血液氏杆菌、B—溶血性链球菌、葡萄球菌、克蕾白氏杆菌、假单胞菌、奈瑟氏菌、巴斯德氏菌、变形杆菌。所有这些病原菌都能从正常犬的鼻咽部分离到，仅仅支气管败血波氏杆菌是呼吸道的原发性病原体，虽然它也能作为在犬呼吸道感染和犬瘟热病程中的继发感染。也有学者指出，在呼吸道传染病中，支原体值得引起重视。

一、支气管败血波氏杆菌

在早期的研究中，曾从犬瘟热患犬的呼吸道分离到支气管败血波氏杆菌，因此认为它是犬瘟热的病原。但是，后来的研究证实了犬瘟热是由病毒引起而把这一病原归结于继发感染。近期的研究表明，这一病原作为呼吸道疾病的原发性病原体。可以引起犬的窝咳。

大量的实验研究证明，犬吸入的支气管败血波氏杆菌，可以在呼吸道特别是气管、支气管粘膜上迅速移地发育，并集聚到有纤毛的粘膜表面。这一病原菌不能穿过粘膜屏障，但在感染后4天会引起急性炎症反应，结果导致以呼吸进内粘液性或粘液脓性渗出为特征的气管支气管炎。临床上表现为不同程度的咳嗽、鼻涕。病程至少1—2周。但病原菌能在呼吸道内残存好几个月，因而要特别重视带菌动物。

该菌的感染呈高度接触传染性，可以在接触带菌犬或病犬的犬群中迅速传播。康复犬可获得免疫，免疫期约一年。除了与其它感染并发之外，单纯的支气管败血波氏杆菌的流行病学和病理学研究还记载很少。但是，在实验研究中发现，病理变化类似于先前描述的其他一些接触传染的呼吸道疾病，或死于其他疾病的 “窝咳”患犬。

另外，有报道指出，本菌还能在猫之间甚至在人群中迅速传播。

二、支原体

一些研究者已从临床正常犬和病犬分离到10种不同的支原体。支原体在犬群中能迅速传播，感染率高达80 ％以上。病原体的排出期达数周。人工感染易感犬，症状很轻，但是能加重其他呼吸道病毒感染的程度。

三、犬腺病毒

犬腺病毒（属DNA病毒）有两种不同的血清型，即CAV—1传染性肝炎病毒）和CAV—2（Toronto A－26／61，又称传染性喉气管支气管炎病毒）。两者都与自然发生的呼吸道感染有关。在实验研究中，以两种病毒口服感染犬，都能引起轻度的咳嗽和呼吸迫促。

CAV—1常与急性全身感染有关。易感犬是否发生全身症状或者仅局限于呼吸道感染，主要与感染的途径有关。但是已经证实了在犬呼吸道疾病中，CAV—2比CAV—1更有意义。这两种病毒在呼吸道引起的病变相似，主要表现为呼吸道的坏死性支气管炎、鼻甲和扁桃体上皮的局部坏死。病变消失较快。康复犬能产生免疫，且免疫期较长。这两种感染都可在呼吸道粘膜检测到核内包涵体。

四、犬疱疹病毒

犬疱疹病毒能引起幼特别是2周龄以下的幼犬肺炎。这种病毒能从无症状的成年犬呼吸道分离到，因此认为成年犬可能是最大的健康带毒者。本病毒在签之间的传播较慢。较老的犬在受感染后发生浆液性鼻涕和有时咳嗽。呼吸道病变比犬腺病毒或支气管败血波氏杆菌感染轻一些。但是，在鼻甲到气管支气管粘膜都可发生病灶性坏死。上皮细胞的包涵体数量在各犬之间有些差异，但通常数量很少。

五、犬副流感病毒

SV—5犬副流感病毒（瞩RNA病毒）是呼吸道传染病较多见的病因。临床症状主要是发热、流涕、咳嗽。病程至少1—3周。病理变化表现为卡地性鼻炎和支气管炎。当和支气管败血波氏杆菌或支原体温混合感染时，病情更加严重。应激和环境因素，促进在易感犬群中的传播速度，并加重症状。单纯的犬副流感仅表现为轻度或亚临床赶染。

六、呼肠病毒

虽然已经从血清学方面证实了三种不同血清型的呼肠病毒在犬群中的流行，但是还没充分的证据说明它在直接接触传染的犬呼吸道传染病中的实际意义。这种病毒能从正常犬的呼吸道和病大的呼吸道分离到，但在实验条件下仅能引起非常轻微的症状或亚临床感染。

临床症状经常仅表现为温和的周期性于咳。严重病例可发生阵发性咳嗽。通常病犬保持食欲。易感犬在接触病犬后5—10天发生咳嗽，持续数天以至数月。有些病犬也表现为浆液性或装浆脓性鼻涕。一般能治愈，个别的转为严重的支气管肺炎，发热、精神沉郁、渐进性衰弱，以至死亡。由于能很快发生免疫，所以排毒期仅为几天。

另外，一些人的呼吸道病毒也能传染给犬。现在已知的主要是人流感病毒和合胞体病毒等。

诊 断

呼吸道传染病的临床症状是许多呼吸道病原体共有的，不易区别。病原体主要依据实验室检查。在活体，可采取以鼻拭或喉拭进行实验室细菌学和病毒学检查。病采取双份血清作试管凝集试验，以检测呼吸道细菌和病毒抗体的升高情况。病理解剖可见支气管肺炎或气管和支气管粘液脓性分泌物（分泌物中含有病原体）。在呼吸道病毒引起的病例，一般没有特异性的组织学变化。但是，腺病毒引起的呼吸道疾病的组织学变化有一个重要特点，即呼吸道上皮细胞内有核内富尔根（Feulgen）反应阳性包涵体。在缺乏包涵体时，以组织学论断采来区别呼吸道感染的类型是困难的。在所有的呼吸道病毒，用免疫荧光检查常比包涵体检查灵敏。支气管败血波氏杆菌病通常以气管支气管炎为特征，在呼吸道上皮表面有大量病原菌。

鉴别诊断主要是排除犬瘟热和细菌性支气管肺炎。任何成窝暴发的病例，都和不同的呼吸道病原体或病原体的混合感染有关。这些呼吸道疾病多为自限性，病程在1～3周，很少发生全身症状。偶尔，奥斯勒丝虫病也可出现类似的呼吸道症状，但可利用支气管镜和粪便检查囊蚴来排除。

防 治

在一般情况下，甚至在病毒作为原发性病原体时，都可以考率利用母源抗体或气雾疗法。治疗多是针对临床症状进行对症治疗，可使用可待因制剂以减轻咳嗽。由于大多数病例不太严重，因此可以收到效果。抗生素的使用仅限于细菌引起的疾病。已经证明，庆大霉素和卡那霉素对支气管败血波氏杆菌病疗效很好。

至今没有一种可靠的疫苗可以预防所有已知的呼吸道病原体。对支气管败血波氏杆菌病和犬副流感，可能还有其他病原体，主要的防卫机制是靠局部分泌抗体反应和局部细胞免疫；血清抗体和抗病力之间关系不大。鉴于这种情况，鼻内给予疫苗比皮下或肌肉注射效果更好。另一方面，已有研究证明，皮下接种CAV活疫苗，特别是CAV—2活疫苗，可以提供呼吸道抗腺病毒的完全或基本完全的保护。一般来说，最好对所有犬进行犬瘟热和腺病毒的防疫注射。

预防支气管败血波氏杆菌病，可以用S55无毒菌株鼻内接种。这种菌株的生长繁殖，引起呼吸道局部分泌 IgA抗体，而这种抗体可以对以后致病性菌株的感染产生免疫。而且同时也产生体液抗体，但血清抗体滴度和抗感染力无关。疫苗能产生完全或基本完全的保护，使病原体的数量减少以至排菌期缩短。接种后48小时大约20％、接种后5天有85％、接种后14天至少有95％的犬得到保护。这种保护至少可维持10～12个月。

人工感染犬副流感病毒的犬很少发生临床症状，但是可增加支气管败血波氏杆菌病的严重程度和病程，因此防疫后可明显减少窝咳。疫苗是在犬肾细胞系上培养致弱的活CPIV毒株，可以由皮下或肌肉接种而产生高滴度的抗体。一般推荐使用两个剂量，因为注射一个剂量后抗体滴度会迅速下降。防疫后能使致病性毒株的排毒期缩短，但不能完全限制排毒。

来自: 公安部南京警犬研究所

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新生犬感染犬疱疹病毒而死亡的报告

一、临床症状：

主诉该犬场刚开始有一窝新生犬（产后１０天）突然发生死亡，当时并没有引起足够的重视，而后１５窝（１０５条）中的１２窝（７８条）幼犬在产后２周内都发生类似的病症。共死亡６９条。其发病率为７４.２％，死亡率为８８.４％。而该犬场3周龄以上的仔犬很少发病。发病犬的症状主要表现为上呼吸道感染，流清鼻涕，体温升高，病犬精神迟钝，呼吸困难，喜卧不爱动，有的新生犬甚至完全停止吮乳。粪便稀软无臭味，色泽黄绿。轻压腹部，病犬即发出痛苦的嚎叫声。有些病犬连续发出痛苦的呻吟。共有６条犬虽然外观健康,但吮乳后经常出现呕吐症状。本病病程很短，多数病犬在出现症状后２４小时内死亡，病程长的也不超过４８小时。在９条耐过性仔犬中，有６条犬留下有中枢神经症状的后遗症，表现共济失调，向一侧作圆周运动或失明等，致使仔犬失去饲养价值。

二、病理变化：

我们对已死亡的２３条犬剖检，共有的特征性的病变表现为：各实质脏器表面散在直径约为２－３mm的灰白色坏烈灶和小出血点。肺和肾的变化更为严重，肾皮质层散在灰白色的坏死亡灶，而后包膜下则有红的出血点。腹腔和胸腔内常有带血的浆液性的体液积留。但也有个别病例表现为脑膜炎变化，脑膜出血，水肿。

三、诊断：

1、经过一段时间用抗生素治疗，本病没有得到很好的控制。

2、无菌采取肾、肺和肺门淋巴结的病变组织，按常规方法处理后取上清接种犬肾单层细胞培养物，置于３５－３６℃培养。经2代盲传，我们发现细胞即开始圆缩变暗，经７２小时后，大部分细胞出现病变并开始脱落，此时收获，经处理作电镜检查。发现病毒具有典型的疱疹病毒形态特征。所以我们诊断为仔犬犬疱疹病毒感染。

四、治疗：

在确诊为犬疱疹病毒病以后，在继续用广谱抗生素控制继发感染、补液及用抗病毒药的同时在仔犬发病早期，用抗病毒血清腹腔注射１－２ml，起到了一定的治疗作用。另外用该血清对同窝未发病仔犬的紧急预防，也收到了良好的效果。在以后的治疗中，我们用上述方法成功地治愈了两窝刚发病的仔犬，有效控制了该犬场未发病仔犬再发犬疱疹病毒病。

五、结论：

１、新生仔犬（3周内）急性死亡严重养犬业的发展，我们临床工作者应尽早想办法了解和控制此类疾病的发展。

２、对新生犬感染犬疱疹病毒病的诊断可根据以下几点：

2、1、发病特点和临床症状：患病仔犬发病急，死亡快，死亡犬都在两周龄内的新生犬，而且成窝发病，应怀疑本病。主要症状表现为呼吸道感染，呼吸困难，体温升高，病犬精神迟钝，食欲不良甚至完全停止吮乳。粪便稀软无臭味，色泽黄绿。轻压腹部，病犬即发出痛苦的嚎叫声。本病经过很短，多数发病犬在出现症状后２４小时内死亡，病程长的也不超过４８小时，而且主要见于年龄较大的仔犬。

2、2、病理变化：病死犬的病理变化主要表现在各实质脏器以灶性坏死和出血变化为主的特征性变化。肺和肾变化最为明显。

2、3、病毒的分离是准确可靠的方法，但由于受各方面的影响，基层单位很难做到，可应用荧光抗体染色法诊断本病。用家兔制备荧光抗体高免血清，病变部的组织涂片可供荧光抗体染色用，在坏死灶及其边缘能看到大量发荧光的病毒抗原。

3、治疗：

3、1、患犬最好放入３６－３７℃和相对湿度约５０％的恒温箱内。

3、2、用广谱抗生素控制继发感染、补液及用抗病毒药。

3、3、特效治疗：在仔犬发病早期，用感染过本病的康复犬血清，中和抗体效价达到１：８以上，腹腔注射１－２ml即有治疗作用。也可用于同窝未发病仔犬的紧急预防。但无论是治疗还是紧急预防必须在早期，到中后期效果就不很理想。

４、预防：

4、1、平时注意犬和犬舍的消毒和卫生，一旦发现病犬要立即隔离。

4、2、本病尚无疫苗。但高发犬场可制备组织灭活苗，给妊娠母犬多次接种，提高母源抗体，对增强仔犬的成活率有着十分重要的意义。

５、鉴别诊断

本病应与新生犬链球菌感染和新生仔犬溶血症相区别。但新生犬链球菌感染为细菌病，用抗生素能有效控制本病。而新生仔溶血症为非传染性疾病，而且会出现黄胆、溶血、和血红蛋白尿。

来自: 公安部南京警犬研究所

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用PCR技术检测犬的结核病

结核分枝杆菌可引起犬肺、胃肠道或传播性疾病。由于与患结核病的人或牲畜接触较多，犬可能传播结核病。传播途径主要是呼吸道、消化道或接触传染。犬对结核分枝杆菌和牛分枝杆菌一样敏感，但在农村大部分犬被结核分枝杆菌感染或由于带菌患者接触而引发此病。犬最常见的感染部位是支气管淋巴结和肺。

虽然对患病的犬用适量异烟肼和链霉素进行治疗，但还没有药物治疗有效的报道。被感染的犬通常有开放的病灶，有感染的分枝杆菌通过唾沫、尿液或粪便排出体外、并对人构成威胁。该病犬在早期和中期通常无症状，甚至活动性和有开放性病灶的犬也能长期无症状。因此，对病犬早期诊断很困难。犬的肉眼病灶易混淆，类似于肉瘤病灶而不是典型的结核结节。鉴别诊断应包括真菌性肺炎和寄生虫性肺炎。组织病理学检查和培养分离此菌，对诊断起决定作用，但培养和鉴定本菌时间太长。

本实验用DNA扩增的方法检测，从治体或剖检犬收集的组织样品中结核分枝杆菌复合症的病原。将PCR检测的结果与组织病理学和传统培养法进行对照。

材料和方法

收集4只怀疑结核病的犬，主要临床症状为食欲减退、呕吐、体重减轻，间歇热、嗜唾、呼吸困难、淋巴结肿大。两位主人有结核病史。对病犬做了尸体剖检和治体组织检查，对所采取的样品进行了组织病理学、细菌培养、槐黄染色和PRC检测。

组织病理学检查：将样品用100%的福尔马林缓冲缓液固定，石蜡包埋，制成4am厚的切片，然后用苏木精和曙红染色。

细菌学检查：将组织样品等分，1份贮存于零下80摄氏度条件下，以备重复试验。另一份取5g带病灶的样品切成小块，加无菌蒸馏水用匀浆机（IUC）处置15分钟使之匀质。然后取2ml匀浆用Tacquet和Tison（1991）的方法去污，并取10ml匀浆加入加入10m10.75%氯化脱环已基吡啶（hexadecylpyridinium chlorid）进行去污，将混合物在Sigma3—10 离心机心1068转速离心30分钟，沉淀，接种于Coletsos 和无甘油的Lowenstin 两种培养基，每周观察其生长情况，对疑似分枝菌菌落用萋一纳氏技术检查嗜酸菌，对分离菌按其形态特征及生化特性来鉴定，还用Accuprobve 探针（基因探针检测结核分枝杆菌和牛分枝杆菌）。

涂片检查；参考（1976）的方法将培养物用槐黄酚盐粉色制成涂片，用400倍荧光显微镜检查此片。

DNA提取：用 litbana 等（1995）描述的方法列解细菌提取DNA，即将去污的样品加热灭活、离心，沉淀用100al蛋白酶K（0.1mg/ml）液重于56摄氏度1小时，再煮沸5分钟，用20000离心机离心5分钟，将上清液用 纯化系统处理，提取DNA。

DNA扩增：用两对寡核苷酸引物进行PRC扩增来检测提取的DNA样品。第一对引物IS43（5’TcA Gcc GcG Tcc AcG ccG ccA3’）和IS41(5’CCT GCC AGC GTA GGC GTC GG3’)分别与IS6100插入成份的568至588和884至865的碱基配对。第二对引物TBIF（5‘GAA CAA TCC GGA GTT GAC AA3’）和TBIR（5’AGC ACG CTG TCA AGC ATG TA3’）和TBIP（5’AGC ACG CTG TCA AGC ATG TA3’）对MPB70基因的276至295和647至628的碱基配对。两个反应用PIC—100程序控温仪在标准条件下进行，每个反应加50ngIS41、50ngIS43及20ngTBTIF、20ngTBIR寡核苷酸退火温度分别为68摄氏度、60摄氏度。扩增的DNA主段大小分别为317bp(IS110) 372bpCMpB70基因），用2%的琼脂糖凝胶电泳经溴化乙锭（0.5ag/ml）染色检测扩增结果。每组实验包括阳性和阴性对照。

用Mutu—GeneR体外诱变试剂盒（BIO—RNA ）来定点诱变寡核苷酸构建重组质粒。对照质粒PPG10，含有IS41和IS43反义链寡核苷酸序列，且被1250碱基分隔，这一质粒通常被用作IS6110PCR扩增时对照。

Southem印迹杂交；通常用于检测PCR产物的特异性。电泳之后，被扩增的DNA通过Southem印迹被转移到带正电荷尼龙薄膜上，这一过程用785真空印迹装置（BIORAD）可变真空泵在40mbar于0.4N氢氧化钠溶液中进行。将薄膜在2xssc中浸泡（0.3M氯化钠、0.03M柠檬酸钠），经空气干燥，以120摄氏度20—30分钟加热固定DNA。

通过PCR技术扩增分枝杆菌IS6110和MPB70双链DNA，并用地高辛配体---N ----duPT标记制成探针。寡核苷酸IMS1（5’GCT GAG GGC ATG GAG GTG GC3’） INS2(5’GCG TAG GCG TCG GTG ACA AA3’)及TBIF和TBIR分别用于纯牛分枝杆菌染色体AH5DNA 245bp和372bp片段的扩增。该反应在地高辛配体—11—duPT加入DNTPS混合比例为1：3的条件下进行。PCR产物用Nugic Miniprips(Promega)纯化。

将薄膜用5乘以SSC，0.1%的N一十二烷基肌氨酸，0.02% 的十二烷基磺酸钠及0.1%的阴断抑制剂在42摄氏度下温育过液。杂交后的薄膜 在室温下用2XSSC，0.1%十二烷基磺酸钠洗耳恭听涤2次，每次5分钟，之后用0.5乘以SSC，0.1%的十二烷基磺酸钠在42摄氏度洗涤2次，每次15分钟。

此高辛配体检测法：现在制造厂推荐用碱性磷性磷酸酶标记抗体DNA检测试剂盒以及氨蓝四唑和X—磷酸酶比色检测地高辛配体标记探针记探针的存在，产生影像影印到乙酸幻灯片上（3M）并被拍摄下来。

结果

1一只犬（1号）患有粟粒状的结核，胸、腹部器官广泛弥散性结节，有严重的干酪样变和钙化，皮肤可见痿孔损害。

2眼观及组织病理学检查，可见犬的结核病变。

3从怀疑患结核病的一只犬（1号）培养分离到结核分枝杆菌。

4用根对IS6110插入片段和MPB70基因的引物作PCR已证实细菌培养为阳性的犬（1号）患结核分枝杆菌复合症。另外3只犬的样口细菌培养为阴性，PCR检测结果也为阴性。阴性对照排除了样品DNA被污染的可能，内部对照质粒也未出现假阴性结果。

细菌培养，涂片检查及用PCR对病犬检测结果表明，用琼脂糖凝胶电泳，经溴化已锭染色检测临床样品PCR扩增的DNA。IS6110和MPBA70探针及Southem印迹分要，证实了从1号狗提取的DNA经PCR扩增产物的特异性。

由于结核病在发病和潜伏上的特点，对人类已构成了威胁。但犬的结核病没有引起人们的足够重视。引外，犬的结核病又作为人的结核的指示，因为犬病可能是由人传染的。如1号犬在表现出任何临床症状之前，其主人被确诊为结核病。同时也证明PCR是检测犬结核的准确而有效的办法

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英特威犬瘟热疫苗免疫效果比较试验

1、前言

近年来,在几个欧洲国家已经报道了犬瘟热爆发的病例，在疾病流行期间，接种疫苗的动物并没有获得完全保护。为此，这几个国家的有关研究机构对现行使用的犬瘟热疫苗的效力进了评价，结果发现不同疫苗的保护效果存在显著的差异。

本文列出了两次研究的结果，一次由芬兰的Sihvonen教授进行；另一次在Uppsala的瑞典国家兽医研究所完成。

当这些研究结果发表以后，英特威对本公司生产的Nobivac Puppy DP（犬瘟热、细小病毒二联苗）和Nobivac DHPPi（犬五联苗）中的犬瘟热病毒（CDV）成分的效力进行了评价，现也将有关这方面的三次研究结果报告如下。

2、芬兰Sijvonen教授的研究

（1）材料与方法

参试疫苗： A（英特威），B（F厂牌），C（H厂牌），和D（S厂牌）。

使用上述四种不同厂牌的疫苗分别对狗接种一次或两次，从550只免疫狗采集血样，通过病毒中和试验（VN）测定每份血样的CDV抗体效价。在四个疫苗组之间，比较第一次和第二次接种性抗体效价的动物的百分比。

（2）结果

第一次接种疫苗时，动物的平均年龄是85+15天；第二次接种疫苗时，动物地平均年龄是111+14天。

在第一次和第二次接种疫苗以后，获得保护性抗体效价的动物的百分比详见图1和图2。

3、Uppsala瑞典国家兽医研究所的结果

（1）材料与方法

从瑞典各地的兽医诊所送检1848份狗的血清样本，这些狗都曾经接种了犬瘟热疫苗，每只狗免疫的次数从0到14不等，平均为2次。

根据疫苗接种史可以将这些动物划分为5类：仅使用A（英特威）疫苗接种；仅使用C疫苗接种；仅使用D疫苗接种；使用两种或两种以上不同厂牌的疫苗接种；从未进行过疫苗接种。

测定每份血清样本的CDV病毒中和（VN）抗体效价，在5个组之间，比较VN效价大于16的动物的百分比。

当这一研究结果发表以后，瑞典政府信函通知全国的兽医师：凡使用D疫苗接种的狗均应视为未免疫动物。

4、英特威进行的研究

维斯堪的纳维亚的研究结果发表以后，英特威进行了几次研究，以便再次确定本公司生产的犬疫苗产品中CDV毒株的效力。

（1）在荷兰进行的效力研究

a、材料与方法

试验动物包括7个不同品种的105只狗，其中半数（52只）狗在6周龄时接种Nobivac Puppy DP(犬瘟热、细小病毒二联苗)疫苗；其余53只狗不接种疫苗作为对照。

在疫苗接种以前和接种以后3周，两次采集的动物的血样，测定Nobivac Puppy DP疫苗接种组中发生血清学转换的动物的百分比。

b、结果

接种疫苗以后，发生血清学转换的动物的比例是83%。

（2）Nobivc Puppy DP与E疫苗（M厂牌）的比较研究

a、材料与方法

本次试验包括6个不同品种的63只狗，全部在6周龄时接种疫苗：32只狗使用Nobivac Puppy DP疫苗；31只狗接种E疫苗（CDV和CAV二联疫苗）。

在疫苗接种以前和接种以后3周，两次采集动物的血样，比较两个组之间发生免疫反应的动物的百分比。

b、结果

结果详见图4

（3）Nobivac DHPPi 与F疫苗（M厂牌的比较研究）

a 、材料与方法

本次试验包括81只狗，全部在12周龄时接处种疫苗：41只狗使用Nobivac DHPPi疫苗；40只狗接种F疫苗。

在疫苗接种以前和接种以后3周，两次采集动物的血间发生免疫反应的动物的百分比。

B、结果

由于在试验以前，8只动物感染了CDV或接种过CDV疫苗（英特威组5只；F组3只），被从试验中除去见图5。

5讨论

近年来几个欧洲国家曾经接种过疫苗的狗仍然爆发犬瘟热的病例，基于这一情况，在芬兰和瑞典市场上撤回了他们生产的疫苗。两次在斯堪的纳维亚进行的研究与项特威兽医服务部出版的“通讯”第12期（1996年5月）和第13期（1996年11月）报告的6次比较试验结果相符合。6次比较试验表明：英特威生产的Nobivac疫苗是唯一适合于初次免疫的产品，最后一次加强免疫在12周龄。上述英特威的研究结果（4.3.a）进一步证实了这一结论。

另外的两次研究表明：在6周龄存在母源抗体的情况下，使用Nobivac Puppy DP接种的免疫效果是非常可靠的，这一结论与Chalmers等的攻毒试验结果相一致。

6结论

英特威含CDV成公的犬疫苗优于其它同类疫苗产品，具有更强的市场竞争能力。

7参考资料

[1]Sihvonen L .Symposium of the Minietry of Agriculrure Finland . May 8,1995,Helsinki.[2]Olsen. P, Klingenborn B,Bonnet B and A . Hekhammar.(1997),Proc.ACVIM forum,15:685.[3]Tipold A,Jaggy A and Vandevelde M.European joural of Companion Animal Practice ,1996,6,33—38.[4]Blixenkrone—M ller M,Svansson V,Have P,Orvell C,Appel M,Pedersen I,Dietz H and Hendriksen P.Veterinary Microbiology.1993,37:163—173[5]Baxendal W .and Chalmers W.K.S(1994). Veterinary Record.135:349—353.

来自: 英特威国际有限公司 丘鹤英

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犬大肠杆菌研究概况

大肠肝菌主要引起新生仔猪、犊牛和婴儿的急性腹泻，在犬中主要引起腹泻和尿路感染，在母犬还常常引起子宫炎，成年犬睾丸炎，引导起精子数量下降。我国对引起新生仔猪、婴幼儿腹泻的大肠杆菌研究较多，但迄今为止尚未见到有关大肠杆菌引起犬发病的报道。根据国外研究概况，本方从六个方面对犬大肠杆菌流行及致病情况简要介绍。

血清型分布：英国（Bush.B.M1974）报道有O4、O25、O42。1978年Aska J等报道轿清型O4、O25的大肠杆菌能引起新生犬腹泻、法国（Jaque.1978）在67条母犬中分离到O4、O6、O26血清型的E.coli，南斯拉夫（N aflic.1978）为O24，麦（Asde,J,1979）主要是O4、O25，保加利亚（Toss.M.1981） 报道有O2、O4、O6、O23，意大利为O1、O2、O33、O50、O60、O84、O85、O120、O138、O158埃及Shoeman M.T(1982)对流浪狗进行了大肠杆菌分离，在200份样品中分离出107株E.coli，其中11株有致病性，血清型为O2、O15、O26、O88、O103、O127，德国（Wilk,1983）报道有24个血清型，O4最为常见。

病理变化：大肠杆菌引起的急性感染，主要表现为败血性栓性肺炎、纤维素性脓性胸膜炎、淋巴细胞浸润性肺炎、肾盂肾炎、肾小管肾炎。上述病变主要是由于大肠杆菌产生的脂多糖内毒素热不稳定毒素所致。亚急性表现为胃肠炎，慢性主要表现为心内膜炎。

致病因子

1 毒素 某些致病性大肠杆菌菌株能产生热不稳定毒素（LT）、热稳定毒素（ST）。细胞毒素性菌能产生Vero毒素1和2。Wilk等（1982）报道从胃肠炎狗分离到的能产生a—溶血素的大肠杆菌能产生溶血素ST，能合成细胞毒性坏死因子（CNF）。Baljer等（1986）用酶标记控针发现从患胃肠炎的犬中分离出的5株溶血性E.coil中具有编码ST的基因，血清型为O42：H37，位于98MD的质粒中，未定型的ST1。基因们于80MD的质粒上。J P arda(1991)用核酸探针和免疫斑点试验检测了产生溶血素的24株E.coli(Hly+),8株带有编a—溶血素基因的质粒，16株带有染色体HIY决定族，其中12株有肠毒素活性，三株是O42：H37,两株是O70H--，带有HLY质粒，同时也带有编码ST1a,ST2a或LT 所有24株查到17株产生细胞毒性坏死因子（CNF）：16株为CNF，1株未能定CNF型。Gyles.C(1996)用DNA杂交和PCR扩增试验鉴定犬E.coil表达肠毒素（Stap、STb和LT）及Vero毒素（VT1和VT2）基因。在腹泻犬粪便培养物中查到VT1、VT2STa、STb。 在正常犬中未查到VT2Sta、STb.。在腹泻犬和未腹泻犬中都查到VT1，未能查到LT1。ST毒素及VT2可能与犬得泻有关。 上述报道都未能证明LT毒素有存在，P.Olson(1985)从混合感染了克雷伯氏杆菌和大肠杆菌的狗分离出E.coil，他通过中国仓鼠卵巢细胞、免皮试验和免肠结扎实验证实了LT的存在。

2 粘附因子 肠致病性大肠杆菌（EPEC）能表达F4、F5、F6、F41和F165，而肠毒素性大肠杆菌（ETEC）则无。英国的Hat.C.A发现，在犬粘膜活体组织培养上，EPEC（O11）感染小时后就能吸附到微毛，8小时钻入刷状缘，导致刷状级增厚，24小时后，几乎所有刷状缘全部脱落。引起尿落感染的E.coli(UPEC)能产生F11或F13，C能吸附到犬肾上皮细胞（MDCK），导致尿路感染。

与人大肠杆菌的关系；荷兰的Garcaia(1989)报导从发病犬中分离的UPEC菌株具有种特异性，不能吸附到人的膀胱上皮细胞（T24）上，可能是鞭毛亚单位带有不同的粘附因子。同时LT毒素不能被人的抗LT血清中和，不能凝集人LT包被的金黄色葡萄球菌。Wein（1989）用琼脂糖凝胶电泳研究了E.coili的质粒图谱，其中168株分离自腹泻犬粪样品，118株分离自健康犬粪样品、328株从犬主人粪便所分离，20%的E.coli无质粒，其余的菌株表现11种不同的质粒图谱。ETEC只从病犬中分离到，都包含粒。一般讲从家养犬中分离的E.coli和从该主人孩子中分离到的E.coli 的质粒图谱一样。D.A.Low(1998)对从感染尿路的犬和病人中对E.coli进行了分离和比较。他比较了四株犬UPEC和6株人的UPEC的基因型和表现型，有一定相关性或一致性。通过southern blot试验分析，所有的菌株都包含相似的肾盂肾炎相关菌毛（PaP）、a溶血素（Hly）和插入序列5（IS5），相似的外膜蛋白、菌毛蛋白和质粒图谱。所有菌株都表现对神经氨酸酶敏感。与此不同的是，大多数人的UPEC能识别二半乳糖残基的末端。以上这些研究说明犬和人的E.coli有一定相关性。

治疗

犬大肠杆菌对呋喃唑酮、呋喃西林、荼啶酸、粘菌素、多粘菌素、庆大霉素和诺氟沙星敏感，对青霉素、卡那霉素、链霉素、氨苄青霉素和四环素有抵抗性，对磺胺二甲氧嘧啶、横胺嘧啶和TMP报道比较混乱。

来自: 农业部动检所

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846合剂及氯胺酮注射液对犬的麻醉

由于对犬施行手术、治疗，保定的需要，临床上经常要用到麻醉。但若麻醉药使用不当，会加大麻醉副作用，影响治疗效果，甚至引起动物生命危险。笔者观察了上千例经846合剂及氯胺酮注射液麻醉的犬，其中既有严重脱水或中毒的病危犬，也有需做绝育手术或剪毛修趾的健康犬，既有不满2月龄的幼犬，也有十多岁的老龄犬。下面笔者就临床应用这两种麻醉药的体会分述如下。

一、846合剂与氯胺酮的联合应用

846合剂又称速眠新注射液，是静松灵、乙二胺四乙酸（EDTA）、盐酸二氢埃托啡和氟哌啶醇的复方制剂。该药使用方便、麻醉效果好、副作用小，已广泛应用于动物的麻醉。氯胺酮注射液用于麻醉，具有出现作用快、持续时间短的特点，但其肌注效果常不理想。一般说来，该药不适合单独用于犬的麻醉，因其可明显抑制犬的呼吸并常使犬出现强直性痉挛，有时甚至在麻醉后的两天都有痉挛的现象发生。但846合剂与氯胺酮注射液合用往往能过到更好的效果。合理调整二者的比例可减少麻醉剂用量、缩短麻醉诱导期、合理调整麻醉时间。使用846合剂对犬麻醉时少量加入氯胺酮注射液混合注射，能减少麻醉药用量并使动物较快进入麻醉，较早苏醒，对846不敏感的犬也能很好的进入麻醉状态。

二、适宜的剂量

846合剂的推荐剂量犬为0.1ml/kg体重，肌肉注射。氯胺酮用于短时麻醉的推荐肌注剂量为20—30mg/kg体重。但实际操作中往往不用这么大的剂量就能达到很好的麻醉效果。一般重5kg的犬，用0.3—0.4ml就能达到麻醉1—2小时的目的。如再加入0.1ml(5kg)氯胺酮，则对846不敏感有犬也能很快很好的进入麻醉。若想减少麻醉时间可加大氯胺酮的比例。但一般说来，846与氯胺酮的比例以3：1较为合适，麻醉效果好而麻醉药的副作用降为最低。混合麻醉剂量一般以0.08ml/kg体重为宜。麻醉药的剂量加大，动物较快进入麻醉，而较晚苏醒，反之亦然。犬一般在肌注麻醉药1分钟至10分钟进入全麻。有时要长一些，笔者数次用的麻醉药药剂量较小，犬在注射15分钟后仍未全麻（不能排除药液注入皮下的可能），但当吸好麻药准备追加注射时，犬却进入了良好的麻醉状态。

影响麻醉剂量的因素主要有：1.品种。纯种犬较杂种犬对麻药要敏感，麻醉剂量宜小；2.年龄。老龄犬对麻药更敏感，用量宜小，幼犬麻醉时间较短，这可能与幼犬代谢旺盛有关；3.体重。较重的犬，每公斤体重的剂量应减少，如一般30公斤重的犬，注射1.5ml的混合麻醉药即能很好的麻醉两小时左右；4.状况。脱水、体虚的犬对麻药较敏感。值得注意的是，不同批次的麻醉药效果不尽相同，使用时须加以注意。

三、麻醉的副作用

首先表现为呕吐。约一半的犬注射后会产生呕吐反应，胃中有食物的犬尤其如此。预防可在麻醉前20分钟肌注小剂量阿托品。这同时还可防止氯胺酮导致流涎的副作用。但一般可不用。另外还表现为心跳徐缓，呼吸受到抑制，一般机体可自选调整适应，除双眼不能闭上外，状似熟睡。双目不能闭上可导致角膜干燥，表现为角膜看起来凹凸不平或象是有水汽凝结在角膜上，当眼睛能闭合时，这种现象就会消失。双目滴入氯霉素抗生素眼药水，也可有效防止角膜干燥的发生。有的犬还会出现舌尖伸出、流涎的副作用，麻醉解除后就能自然恢复，对动物不会有不良影响。有时犬在刚醒或要未醒时，意识尚未完全恢复，会攻击身边的人畜，甚至平时十分温顺的犬也可能误咬自己的主人,应所防范.有的犬在麻醉刚醒时，还会出现大小便失去控制的现象。当麻醉药使用剂量较大时，不但会加大肝脏的负担，而且对胃肠道也有一定影响，犬常麻醉4—5个小时才醒来，其后1—2天都表现昏昏沉沉，也不爱进食。麻醉剂量过大还会引起动物生命危险。因此，临床上应在保证麻醉效果的前提下，尽量减少麻醉剂的用量。

846合剂对犬胃肠道的影响通常都是副面的，如呕吐、胃肠驰缓引起的食欲下降等，但也有少数犬麻醉后食欲大增。

麻醉的副作用也可以加以利用。如用其催吐。当犬过食、吞吃异物、误食毒物，需催吐而又无专用的催吐药时，846合剂是安全有效的替代品。

846合剂的解痉效果也非常好，能有效解除因缺钙、中毒等引起的抽搐，其效果要优于苯巴比妥。同时在犬麻醉中进行输液治疗也很方便。

四、麻醉促醒、麻醉过量的表现及抢救

解除846合剂的麻醉或以846合剂为主的混合麻醉可用苏醒灵4号，与846用量按1：1静注或2：1肌注，通常肌注5—10分钟后，即可促醒。846合剂过量时动物一般表现为张嘴呼吸，呼吸间隔变长，心律不齐，甚至呼吸停止。此时应立即解除麻醉，同时静脉或肌肉注射异丙肾0.1—0.5ml，呼吸停止时并辅以人工呼吸。对氯胺酮过量引起的肌肉强直性痉挛，可肌注安定1—2mg/kg体重或苯巴比妥3—5mg/kg体重。剂量同上。对氯胺酮麻醉尚无合适的促醒解药。但有对仔猪氯胺酮麻醉以氨茶碱催醒的报导（1—2 mg/kg体重，文见《中国兽医杂志》1995，5）。

五、麻醉的禁忌

对脱水、体虚、老龄的犬要减少麻药的用量。对心衰、气喘及脱水较严重的动物要慎用麻醉，并特别注意随时观察反应，一旦出现异常，及时用苏醒灵4号解除麻醉。对气喘严重及呼吸困难的犬，不能施行麻醉。

总之，正确掌握麻醉药的用量，使之既能达到麻醉的目的又不过量，使麻醉副作用减为最低，对患病及手术后犬的康复是极为重要的。

来自: 北京观赏动物医院

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MBP-狂犬病毒NP融合蛋白在大肠杆菌中的表达及NP的纯化

狂犬病毒(Rabies virus)是一种急性致死性人畜共患病，在世界范围内广泛分布。我国由于家犬较多分布在农村，免疫接种不够彻底，狂犬病的危害仍较为严重。目前，国内对狂犬病的诊断主要依据常规的血清学实验，即使用狂犬病毒抗体检测样品中的狂犬病毒或用标准狂犬病毒抗原检测血清样品中的抗体，方法的灵敏度较低，尤其是不能进行狂犬病毒分型。核蛋白（Nucleoprotein,NP）是狂犬病毒毒粒中氨基酸组成最为保守的一种蛋白[1]，适合用其抗体和单抗进行狂犬病的诊断和分型。由于NP主要存在于狂犬病毒的核衣壳内，难以进行分离纯化，目前国内尚无抗NP抗体和单抗。本研究利用以RT-PCR方法克隆到的NP基因在大肠杆菌中进行了MBP-NP融合蛋白的表达，利用亲和层析纯化融合蛋白，因子Xa裂解后,进行离子交换层析纯化得到了NP蛋白，为进一步利用NP制备抗NP抗体和单抗提供了条件。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株与质粒 大肠杆菌TB1，质粒pMAL-C2X购自NEB公司。狂犬病毒3aG株NP基因，由本课题组克隆，并保存在pUC18质粒上。

1.1.2 PCR引物 设计了一对与N基因两端分别互补的引物,由赛百盛生物工程公司合成。

P1:5`AGAATGGATGCCGACAAGTATTGTA3`

P2:5`CGCAATCTTTTATGAGTCACTCGAATATGT3`

1.1.3 主要试剂 Amylose-sepharose购自NEB公司各种DNA内切酶，T4DNA连接酶，Taq酶PCR试剂均购自Promega公司,硝酸纤维素膜、标记有HRP的抗鼠二抗购自Phamacia公司。抗NP蛋白单抗购自美国Chemicon International Inc.

1.2 方法

1.2.1 原核表达质粒pMAL-C2X的构建 将NP基因用XbaI和HindIII从含有NP基因的pUC18质粒上切下，并定向连接到经XbaI 和HindIII 酶切并用低融点琼脂糖法回收的线性化pMAL-C2X质粒上，用酶切图谱和PCR方法筛选含有NP基因的阳性重组子。

1.2.2 MBP-核蛋白融合蛋白在大肠杆菌中的表达自氨苄平板上挑取经鉴定含有pMAL-C2XN质粒的单菌落，接种于含100μg/mL氨苄青霉素的5 mL LB培养基中，37℃250 r/min培养至A600为0.5左右，吸取1 mL培养物，收集菌体。加入IPTG到剩余培养物中至终浓度为0.5 mmol/L，37℃继续振荡培养。在IPTG诱导后2 h和3 h各取0.5 mL培养物离心收集菌体裂解后进行SDS-PAGE凝胶电泳，并用Westen blot检测融合蛋白的表达情况。

1.2.3 MBP-核蛋白融合蛋白的纯化 收集1 L经IPTG 37℃诱导2 h的细菌培养物，重悬于50 mL亲和柱平衡缓冲液（20 mmol/L Tris-HCl,含200 mmol/L NaCl,1 mmol/L EDTA）将样品在　20℃过夜，在冰水浴中融化菌体悬液，在冰浴条件下超声破碎菌体15 s。9 000?譯离心30 min收集上清液，并用柱平衡缓冲液稀释5倍。将样品上预先平衡好的装有支链淀粉-琼脂糖凝胶的2.5??0 cm小柱，待样品刚刚全部进行柱床后，接上蠕动泵，用两倍体积平衡缓冲液进行洗脱，同时用紫外检测器（280 nm）和记录仪观察蛋白洗脱情况，待洗至基线后，换含有10 mmol/L麦芽糖的平衡缓冲液洗脱MBP融合蛋白，将收集到的MBP融合蛋白组分用Amiconcentricon浓缩至蛋白浓度约 1 mg/mL,用SDS-PAGE检测纯化MBP融合蛋白的纯度。

1.2.4 MBP-核蛋白融合蛋白的裂解 将纯化并浓缩后的MBP-核蛋白,分装至微量离心管中，在每20μL融合蛋白中加入1μL浓度为200μg/mL的因子Xa于4℃ 裂解8 、12 、24 h时各取5μL反应液与2譙DS-PAGE上样缓冲液混合4℃保存，最终一同电泳检查裂解情况。

1.2.5 核蛋白的纯化 将经电泳鉴定证明已完全被Xa裂解的融合蛋白裂解液装在透析袋中，置100倍体积的含25 mmol/L NaCl的25 mmol/L Tris-HCl(pH8.0)中进行动态透析，每2 h换透析液1次 ，共3次，将样品上1??0 cm已用含25 mmol/L NaCl的10 mmol/L Tris-HCl平衡好Q-Sepharose柱，用含25～500 mmol/L NaCl 的Tris-HCl(pH8.0)进行递度淋洗，用分部收集器以每管1 mL体积收集A280nm处洗脱峰，最后进行SDS-PAGE电泳鉴定。 1.2.6 MBP-NP融合蛋白和NP的Western blot印迹 按常规方法进行，抗NP单抗和标记有HRP的免抗鼠二抗均按1∶1000倍稀释后使用。

2 结果

2.1 原核表达质粒pMAL-C2xN的鉴定 用XbaI和HindIII双酶切所释放片段大小为1 353 bp，PCR产物大小约为1 353 bp，证明所连接N基因正确（见图1）

图1原核表达质粒pMAL-C2XN的鉴定

2.2 MBP-NP融合蛋白在大肠杆菌中的表达 经SDS-PAGE电泳可见诱导后2 、3 h有一诱导前不存在的分子量大小约98 kD左右的条带（图2），经western blot证明，该条带含NP（图3）。

图2 IPTG诱导后蛋白表达情况的电泳分析

图3 菌体裂解物中表达NP情况的Western blot分析

2.3 MBP-NP融合蛋白的纯化 经前Amylose-sepharose亲和层析纯化，得到分子量大小为98 kD左右的、电泳均一的条带。

2.4 因子Xa裂解MBP-NP蛋白 实验证明，以浓度为10 ng/　L的Xa因子于4℃裂解纯化得到的浓度在1 mg/mL左右的MBP-NP融合蛋白24 h，可使MBP-NP蛋白充分裂解（见图4）。

图4 纯化的MBP-NP融合蛋白, MBP-NP裂解液及纯化NP的电泳鉴定

2.5 重组NP的纯化 将完全裂解后的MBP、NP混合液，上Q-sephrose阳离子交换柱用25～200 mmol/L NaCl作盐浓度递增梯度淋洗，NP在NaCl浓度为60～80 mmol/L时洗下，而MBP在120 mmol/L NaCl浓度时洗脱下来（见图5），经电泳鉴定得到的NP呈电泳均一条带，分子量大小约56 kD（见图4）。

图5 Q-Sepharose 纯化NP的色谱峰图

2.6 纯化核蛋白的Western blot鉴定 用抗NP单抗证明纯化所得到的重组核蛋白抗原性是正确的（见图6）。

图6 纯化NP的Western blot分析

3 讨论

NP蛋白是狂犬病毒毒粒中核衣壳的组成成分，以病毒颗粒为材料纯化天然NP较为困难。天然NP是一磷酸化蛋白，磷酸化位点位于389位的ser[2]。国外研究证明，NP含有四个抗原区，其中I、IV抗原区是非构象依赖性的[3]，这就使利用原核系统表达并提纯的NP制备抗NP抗体和单抗成为可能。本研究利用本课题组自行克隆的N基因，在大肠杆菌中成功表达了MBP-NP融合蛋白，但融合蛋白的表达量较低，这可能与如下因素有关：1）融合蛋白的分子量较大[4]；2）编码N蛋白基因的密码子与大肠杆菌表达的优化密码子差异较大，影响了mRNA的翻译效率[5]。利用Xa因子充分裂解MBP-NP融合蛋白，亲合层析和离子交换层析纯化得到了电泳均一的NP，用抗NP单抗经Werstern-blot分析证明，纯化得到的NP具有良好抗原性，为进一步利用其制备抗体和单抗打下了基础。

九五,"863计划",生物技术领域资助项目(No:863-101-05-03-04)

李伟　张曼夫（中国农业大学生物学院）　张新梅　王树蕙（中国医学科学院基础医学研究所）

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表达狂犬病毒糖蛋白的非复制型重组病毒的构建与鉴定

狂犬病是一种严重威胁人类健康，但尚无法治疗的恶性传染病，唯有疫苗能有效地控制该病的发生。由于当前使用的组织培养狂犬疫苗存在生产成本高、副反应大、热稳定性差等诸多缺点，因此，迫切需要研制高效、安全、价廉的基因工程疫苗，以满足市场的需求。国外和本室相继报道，表达狂犬病毒糖蛋白(rabies virus glycoprotein, RG)的重组痘苗病毒，具有良好的免疫效果［1，2］。虽然痘苗病毒作为基因工程疫苗载体具有许多优越性，然而，其罕见严重的并发症限制了它更广泛地应用。近年来，随着MVA、NYVAC、ALVAC等非复制型痘病毒载体的问世，痘病毒的安全问题已基本得以解决［3］。1994年，中国预防医学科学院病毒学研究所阮力实验室成功地构建了一系列质粒，能定点删除痘苗病毒天坛株中与毒力相关的核酸片段，极大地降低了痘苗病毒的毒力［4］。本研究按人用疫苗标准设计，利用这些质粒进行删除工作。首先，选择能诱生中和抗体的RG基因作为靶基因，将其插入痘苗病毒天坛株的TK区，然后删除痘苗病毒基因组CK片段间与痘苗病毒毒力及宿主范围相关的基因，获得了非复制型重组痘苗病毒VTKRG△CK。现对其减毒特性和免疫原性进行报道。

1　材料和方法

1.1　质粒与菌株　质粒pJSB1 175, pNeoCKLacZ, pNeoCK由中国预防医学科学院病毒学研究所遗传室提供［4］。pNeoCKLacZ和pNeoCK用于删除痘苗病毒基因组C、K片段间与毒力和宿主范围相关基因。pBluescript-RG, E. coli DH5α由本室保存。

1.2　病毒和细胞　痘苗病毒V1 175，为TK区插入LacZ基因的重组病毒，由本室提供［5］；人TK143细胞由中国预防医学科学院病毒所遗传室提供；原代鸡胚成纤维细胞(chick embryo fibroblast, CEF)用9日龄鸡胚，按常规方法制备。

1.3　酶与试剂　限制性核酸内切酶、T4DNA连接酶、lipofectin转染试剂盒均购Gibco. BRL公司；Taq酶购自华美生物工程公司；地高辛DNA标记及检测试剂盒购自Borhinger Mannhim公司；G418购自Sigma公司；抗RG单克隆抗体由美国CDC Dr. Smith惠赠；荧光标记羊抗鼠IgG抗体及辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG抗体由本所免疫室提供。引物1和引物2由病毒所遗传室提供，分别为痘苗病毒天坛株C片段和K片段的两段核苷酸序列，因该缺失载体正在申请专利，具体序列暂不便公开。其他化学试剂均为国产AR级。

1.4　重组质粒pJSB1 175RG的构建参照文献［6］。

1.5　重组痘苗病毒VTKRG的构建、筛选 及纯化　利用pJSB1 175RG与痘苗病毒V1 175在CEF中进行同源重组，将RG基因送至痘苗病毒的TK区，具体方法见文献［5］。

1.6　重组病毒VTKRG中RG基因的检测　常规方法提取痘苗病毒DNA［7］，与地高辛标记的RG cDNA探针杂交，具体操作见试剂盒说明书。

1.7　非复制型重组痘苗病毒VTKRG△CK的构建、筛选及鉴定　以0.01pfu/cell的VTKRG感染90%成片的CEF，37℃吸附1小时后，利用lipofectin将质粒pNeoCKLacZ导入细胞，37℃培养60～72小时后，收获病毒，冻融3次作为重组液。将重组液在含G418 400 μg/ml的CEF中连续传3代；然后在无G418的CEF中传2～3代。将如此处理的重组液感染CEF，37℃培养72小时后铺入含有X-gal和中性红的营养琼脂，随机挑选若干个孤立的蓝病毒斑于含2%小牛血清的维持液中冻融3次。根据它们在CEF和TK143细胞中生长特性进行筛选［8］。将筛选出的VTKRG△CKLacZ与质粒pNeoCK在CEF中进行同源重组，构建VTKRG△CK，方法同前，将挑取的白病毒斑扩增后提取其DNA，以PCR方法进行鉴定。循环参数为：95℃预变性5分钟，95℃1分钟，55℃1分钟，72℃2分钟，共30个循环，72℃10分钟。

1.8　VTKRG△CK在CEF和TK143细胞中生长特性比较　以相同的病毒量同时感染CEF和TK143细胞，37℃培养72小时，染色计数。

1.9　VTKRG△CK表达产物的检测　间接免疫荧光法和Western blot按常规方法进行［7］。

1.10　小鼠中和抗体测定和攻击试验　于0，7天以0.3 ml(2×108pfu/ml)的VTKRG△CK皮下免疫小鼠2次。于14天、21天、28天采血，以小鼠中和实验(mouse neutralizing test, MNT)测定其中和抗体［9］，第21天以10LD50CVS株狂犬病毒肌肉攻击小鼠，观察保护效果。同时，以VTKRG及痘苗病毒天坛株免疫小鼠作为对照。

2　结果

2.1　非复制型重组病毒VTKRG△CK的构建与鉴定

2.1.1　复制型重组病毒VTKRG的构建与鉴定　RG是狂犬病毒5种结构蛋白中唯一能诱生中和抗体的组分，RG基因开放阅读框架全长1 575 bp，编码505个氨基酸的成熟糖蛋白及N-端19个氨基酸的信号肽。将pBluescriptRG中的RV5aG株的RG基因克隆至pJSB1 175质粒中，使RG的表达受P7.5启动子的控制(图1)。构建成重组质粒pJSB1 175RG, 以V1 175为亲本毒种，pJSB1 175RG作为转染质粒，通过二者在CEF中发生同源重组，RG取代TK区的LacZ基因，即从蓝斑中挑选白斑筛选重组病毒。重组病毒经纯化、扩增后，提取VTKRG DNA，以天坛株DNA作为阴性对照，以质粒pJSB1 175RG为阳性对照，打点至硝酸纤维膜上。以地高辛标记的RG基因作为探针进行杂交。结果显示，重组病毒中有RG基因的存在(图2)。

图1　pJSB1 175RG的结构

图2　斑点杂交检测VTKRG中的RG基因

2.1.2　VTKRG△CK的构建与鉴定　首先将pNeoCKLacZ与VTKRG共转染CEF，利用G418-Neo(选择压力)和蓝白斑筛选标记，可得到含有全部质粒序列的中间重组体。去除G418(压力)后，其内部同源序列间发生第二次同源重组，即可获得VTKRG△CKLacZ，基因组中的大部分C、K片段已经缺失，被LacZ取代。为了从VTKRG△CKLacZ中删除LacZ基因，达到人用疫苗研制的要求，再将VTKRG△CKLacZ与质粒pNeoCK在CEF中进行同源重组，用质粒中的CK结构取代病毒中的LacZ, 以获得VTKRG△CK。由于重组病毒缺失了CK间大部分基因，采用引物1和引物2，通过PCR方法可以扩增出一小片段(图 3)。而未缺失的痘苗病毒因其CK间片段过长，无法扩增。PCR结果还表明，VTKRG△CK在CEF中连续传15代后，病毒的缺失区域仍非常稳定。

图3　非复制型重组痘苗病毒VTKRG△CK P5，P10 和P15中 C-K基因片段的PCR扩增结果

2.2　VTKRG△CK在CEF及TK143中的生长特性　痘苗病毒CK区缺失后，其生长特性发生一些改变，如病毒的宿主范围变窄。以相同的病毒量感染CEF和TK143细胞，培养72小时，可见VTKRG△CK在CEF中正常繁殖，出现许多病毒斑。但在TK143中未出现明显的病变(图4)。

图4　VTKRG△CK在CEF及TK143中生长特性的比较

2.3　VTKRG△CK表达产物的检测　间接免疫荧光结果显示，VTKRG△CK能有效地表达RG，表达产物主要分布在细胞膜上(图5)。Western blotting表明，重组病毒表达的RG，酶染后呈一条带，分子量约为65 kD，与文献报道一致，说明CK间片段的缺失并未影响RG的表达(图6)。

图5　间接免疫荧光法检测VTKRG△CK感染的 CEF细胞膜上表达的RG

表1　重组痘苗病毒VTKRG△CK免疫小鼠效果观察

图6　Western blot检测RG的表达

2.4　VTKRG△CK的免疫效果　见表1，VTKRG△CK免疫小鼠，初次免疫后14天，中和抗体的滴度为1∶13，21天中和抗体的滴度上升为1∶151。第21天用10LD50CVS株狂犬病毒肌肉攻击，重组病毒免疫组小鼠全部获得保护；对照组小鼠全部死亡。VTKRG△CK诱生的中和抗体水平和免疫保护效果与VTKRG的相似，表明CK区 缺失对VTKRG△CK的免疫原性没有影响。

3　讨论

非复制型痘病毒载体为彻底解决痘病毒的安全问题，提供了一条新途径。这类载体在哺乳动物细胞中不能完成其复制周期，不产生子代病毒颗粒，但可以有效地表达外源抗原，极大地提高了痘病毒载体的安全性［10］。本研究构建了表达狂犬病毒糖蛋白的非复制型重组痘苗病毒VTKRG△CK。PCR证实，该病毒CK片段间涉及痘苗病毒毒力及部分宿主范围基因已经缺失。Western blot和IFA显示，CK区的缺失不影响VTKRG△CK表达RG。体外实验表明，VTKRG△CK的安全性有了明显提高。与VTKRG相比，VTKRG△CK的生长特性发生了一些改变，虽然二者在CEF中均能正常繁殖，但在大多数哺乳动物细胞中的生长特性截然不同，如VTKRG△CK在人源TK143细胞中几乎不增殖。以前的研究表明，随着重组痘苗病毒接种剂量的增加，小鼠出现毒副反应的机率亦增加，我们用VTKRG△CK以10倍于VTKRG的剂量免疫小鼠，获得了与VTKRG相同的免疫效果，中和抗体的水平和保护效果均与VTKRG相仿，而且免疫小鼠未出现由痘苗病毒引起的毒性反应。这说明VTKRG△CK较VTKRG更为安全。鉴于痘苗病毒的神经毒性能够引起1/107的人，特别是免疫缺陷患者出现进行性发痘和种痘后脑炎，因此我们拟在裸鼠和免疫抑制剂造成的免疫缺陷动物模型中，对VTKRG△CK的减毒特性进行深入研究，客观评价VTKRG△CK的有效性和安全性。

本课题为湖北省科委重点项目(编号981P0904)，并获国家863高科技生物领域及国家自然科学基金(编号：39525001)部分资助

作者：李萍　胡巧玲　王继麟　朱家鸿 (卫生部武汉生物制品研究所基因工程室)；孙朝晖　阮力 (中国预防医学科学院病毒学研究所)

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国内外犬病研究概况

公安部南京警犬研究所 徐汉坤

犬，是最早被人类驯化的家畜之一，现在已广泛使用于军警、科研教学及人们的日常生活中，起着不可低估的重要作用。但是由于犬的各种疾病的发生，不仅造成大批犬包括一些名贵犬的死亡，而且给人和其它家畜的健康带来了严重影响。因此，许多兽医界、医学界的专家致力于研究犬的疾病，并已取得了一些成果。在这方面，国外起步较早，进展较快，近期主要围绕犬的肠道病毒感染、遗传病进行研究。国内则由于多方面的原因，犬几遭厄运，只是近几年来才开始进行研究。主要限于一些危害很大或与公共卫生密切相关的犬病。尽管起步较晚，但也已取得了一些进展。

一、传染病

现在已经明确的犬的几种主要传染病有犬瘟热、犬传染性肝炎、犬病毒性肠炎、狂犬病等。狂犬病由于其对人畜的危害，早被引起重视。国内几家生产的疫苗已证实效果较好。犬温热病自18世纪后叶在欧洲发现． 20世纪初被证实为病毒以来，很多研究者做了大量的工作，并在病原学、流行病学、临床病理学。免疫学方面取得了很大进展，使该病在很多国家已得到了控制。近期主要围绕诊断问题进行研究。在国内，由于犬瘟热病毒能广泛地感染和危害犬科、鼬科和浣熊科的动物，特别是对水貂的危害而引起兽医界的重视。近几年来，哈尔滨兽医研究所、特产研究所进行了一系列研究，研制成功了水貂用的犬瘟热疫苗，有效地控制了水貂犬瘟热病的流行，并对犬的防疫起到了重要作用。这些资料，都已在国内杂志上发表了，为兽医界所共知，这里不另赘述。

这里重点概述犬肠道病毒和腺病毒的研究概况。

（－）犬的肠道病毒

1950年，人们在犬发现了10种人与猿猴的毒苗（ECHO和Coxsachie病毒）抗体，并在正常犬分离到至少10个小核糖核酸病毒、呼肠孤病毒、类星状病毒。1975年，Binn等在患流行性肠炎的德国军犬粪便中分高到犬冠状病毒。美国学者又在1978年发生在几乎全美性的犬传染性腹泻病例中分离到犬细小病毒。到目前为止，在犬已检测到2种病毒的抗体。至少有3种病毒被确定为引起犬肠炎的病毒即犬细小病毒（CPV）、犬冠状病毒（CCV）、犬轮状病毒（CRV）。由于这些犬肠道病毒的高度传染性和较大的危害性，因此1983年在澳大利亚举行的世界兽医大会将犬的肠道病毒作为分组会议的重要选题之一。

犬细小病毒

1978年夏季以后，美国中西部开始流行一种剧烈的消化道障碍和较高死亡率（10～50％）的肠炎，并在短期内扩展至全美各地。1979年从这些病例中分离出CPV，至1980年该病毒几乎遍及全世界。由于其对养犬业的危害，因此受到了各国学者的关注，西方及东南亚各国（包括日本）将本病列为犬传染性疾病研究的重要课题之一。各国主要围绕以下两个方面进行研究：①研究由于基层单位和海关检疫用的快速诊断方法；②研究一种行之有效的灭活和致弱的CPV疫苗，以期控制本病的暴发。这些均已取得了一些成果。在国内，1980年秋在南京等地区的犬群中就出现了疑似本病的流行，1983年用电镜和血清学试验证实了CPV存在，并在以后进行的流行病学、临床病理学、免疫学诊断研究方面取得了一定的进展。

CPV主要危害幼犬。临床症状主要表现为肺炎型和心肌炎型。肠炎到主要是顽固的呕吐和腹泻及明显的白细胞减少。病理变化主要在肠道。组织学检查可见隐窝上皮细胞内有嗜酸性乃至异嗜性的核内包涵体。心肌炎型仅见于3月龄以下的幼犬。死亡率很高，常见4～6周龄幼犬因急性心力衰竭而突然死亡。多数病例死在应激或兴奋期，病犬表现呼吸困难。病理变化主要是肺水肿、心力衰竭和非化脓性心肌炎。有研究认为， CPV对犬的免疫机制产生微妙的影响，从而使犬的某些免疫注射失败。

目前该病毒的检测方法很多，包括电镜、免疫电镜、病毒分离、免疫扩散、荧光抗体、酶联免疫吸附等。但在国内，多利用CPV对猪或罗猴红细胞凝集的特性而建立的血凝和血凝抑制试验。作者曾以此法应用于一次大规模流行，探讨了该病毒自然感染犬的粪便排毒规律，认为该法可以提前4～6天预报疫情。

本病尚无特效疗法。免疫用的疫苗主要是FPV或CPV的灭活或弱毒亩。国内近年已开展了该疫苗的研制工作，但至今还没有一种效果确实的疫苗可供使用。很多地方还只能主要靠引进国外疫苗。

犬冠状病毒

自Binn等1975年首次检出犬冠状病毒以来，许多国家和地区相继报告了CCV肠炎的流行。目前该病毒已遍及全世界。在国内，笔者曾在1985年首次报告了该病毒和CPV的混合感染。

CCv感染多发生于冬季，并经常在成窝或引进感染犬时暴发。幼犬受害严重，主要表现为胃肠炎。成年犬几乎无死亡。临床上，常见CCV和CPV、CRV类星状病毒混合感染。诊断方法包括电镜、病毒分离、荧光抗体等。至今尚无抗CCV感染的疫苗可供使用，其原因可能是对CCV感染的免疫仅局限于肠道，似不能被免疫接种所影响。

犬轮状病毒

轮状病毒是许多幼年动物（包括人）的急性胃肠炎的病原之一。近年来。也在腹泻病犬的粪便中分离出并确定为犬轮状病毒。研究证明，CRV和人的轮状病毒（HRV）无抗原关系。鉴于人和犬接触较多，使人们对CRV 和HRV的血清学关系及种间传递产生兴趣。

（二）犬腺病毒

犬腺病毒感染主要引起犬的肝炎、呼吸道病变和眼睛疾病等。除此以外，尚可以生于狼、狐、熊等动物。近年来，国外已证实存在两株相互有关但各具特点的腺病毒，即腺病毒I（CAV—1），它是传染性肝炎或 Rubarth氏病的病原，且能引起眼睛损伤；而其1型（CAV－2）又称传染性犬喉支气管炎病毒，主要引起呼吸道疾病。

1954年，Cabasso等人从患有严重肝炎的病犬首次分离到CAV－1。以后的研究证实，CAV－1能引起脑病、眼睛损伤（角膜混浊）、慢性肝炎、间质性肾炎、病理变化主要表现为肝炎、胆囊壁增厚水肿呈黑红色。在肝细胞和一些内皮虾胞存核内核酸性包涵体。

CAV－2感染主要表现为持续1～3天的高热、干咳至流浆液性或粘液脓性鼻液、呼吸困难，直至死于肺炎。病理变化常局限于呼吸道，在支气管上皮、肺泡隔细胞、鼻甲上皮有 Cowdary氏A型核内包涵体。

根据流行病学、临床症状和病理学检查仅能作出初步诊断。补反和皮内变态反应可用于诊断。

免疫预防，国外很多国家已有灭活或致弱的疫苗可供使用。有研究表明，CAV－I疫苗能对两种腺病毒产生保护。

（三）其他病毒

最近几年，国外巳从呼吸疾病的病犬分离出和猿猴SV－5密切相关的副流感病毒。在这些病例中，有的还证明和犬腺病毒、犬疱疹病毒、犬支气管腐败波氏杆菌或弓形体合并感染。副流感病毒感染的常见症状是成窝犬发生咳嗽、高热、扁桃体肿胀。有的学者还从伴有后肢麻痹的犬的脑脊髓液中分离出该病毒，认为副流感病毒除了引起呼吸道症状外，还可能引起神经机能障碍。

病理解剖除少数在感染后3天或4天发生肺部出血外，其余无特征性变化。组织学变化表现为呼吸道炎症、呼吸道粘膜和粘膜伴有单核和多核细胞浸润。

副流感病的诊断主要是血清学诊断。国外也已研制成功疫苗用干预防注射。

犬口腔乳头状瘤病毒，侵害犬的粘膜，幼犬特别易感，主要引起花椰菜状疣。一般先起于唇部，继而向口腔内部和喉部蔓延，在4-12周后消失。国外用疣组织悬想加佐剂制成供肌注的疫苗。

犬疱疹病又名犬气管支气管炎病毒，主要侵害乳犬。常引起致死性、坏死性鼻炎和肺炎，少数引起生殖道病变，导致不育、复发性流产和死胎。

细菌性传染病主要是沙门氏菌病、弯曲菌病等。其他对人和其他家畜有危害的结核杆菌病、布氏杆菌病等也一直被高度重视。

二、寄生虫病

犬的寄生虫种类较多。据1957年上海裘明华在《中国狗寄生虫名录》中记载，寄生于犬的有原虫12种、线虫18种、吸虫34种、绦虫17种、蛭1种、蝉25种、螨4种、舌形虫2种、昆虫18种，计131种。由于人所共知的原因，犬的寄生虫的研究进展不快。目前危害较大的是与公共卫生关系较大的绦虫和食道腺虫、恶丝虫、法虫病等。

犬的食道腺虫主要寄生于腹主动脉和胸主动脉管壁中，主要引起呕吐、吞咽困难、干咳、虚弱、麻痹，最终因消瘦或主动脉破裂而死亡。粪便或痰液中查出虫卵即可诊断。以海群生和六氯对二甲苯口服治疗。

犬恶丝虫寄生于心脏的右侧和肺动脉中，主要通过妨碍心脏和心孔的血流以及血检的形成而引起机体扰乱。目前国内分布较广，危害较大。在诊断方面，多沿用采血检查微丝蚴的方法。检出率较低，现在正研究以酶联免疫吸附试验进行诊断。

球虫病主要引起幼犬大规模地发生肠炎。近年来在国内养犬较多的地区时有发生，治疗以呋喃类和磺胺类药效果较好。

三、遗传病

在国外，随着诊断和防治疾病水平的提高，传染病、寄生虫病及其他普通病的重要地位将会降低，继而犬的遗传病将受到重视。虽然遗传病不可能大规模地发生，但常在某一窝或某一品种内发病率较高。美国 Donald（1985）根据已知的常染色体隐性遗传（R）、常染色体显性遗传（D）、不完全显性遗传（ID）、 X染色体隐性遗传（XR）、X染色体显性遗传（XD）、多基因遗传（P）和尚未知（？）的遗传方式对犬的各种遗传疾病进行分类列表，并列出了可供读者参考的所有文献的目录。该表列出犬的遗传性疾病共153种，其中属血液方面的有13种，骨和关节方面的有32种，心血管和淋巴系统的有13种，消化系统的有8种，耳病1种，内分泌及代谢异常的有12种，眼病18种，神经肌肉系统的有24种，其他器官畸形的5种，皮肤病的5种，易感传染病的有14种，泌尿生殖系统的有8种。

因为动物遗传病的分子病理学和人的同类疾病是一样的，但其控制却可以不象人类那样要受道德和社会范畴的限制，因此可以用交配试验和系谱分析、细胞遗传学检查、生化筛选包括一些酶学方面的检查等技术进行遗传筛选。国外一些专门性遗传筛选计划，目前还只限于对比较医学研究有价值的疾病，如犬的遗传性出血紊乱和一些比较名贵的品种。

很多国家早就设有全国性的犬协会，下设专门性品种协会如牧羊犬、使用犬、玩赏犬协会，或者专门性品种俱乐部，对全国的所有犬负责进行评价鉴定，血统档案管理以至计划交配等，这对制订筛选计划和预防遗传性疾病起到了重要作用。事实上也证明，通过这些管理、确定和控制配种，有的国家已消灭了某些遗传性疾病。这种方法在国内实行，现在看来还不可能，即使在管理较严格的军警部门，也还存在一定困难。

随着科学研究的深入，特别是生化技术的发展，犬营养代谢疾病也日益被人们所重视。在国内，也经常可以见到这类报告，较多的有佝偻病和维生素缺乏症和烟酸缺乏症（黑舌病）。由于先进科学技术的相互渗透，兽医诊断方法也日益增多，如免疫荧光、酶联免疫吸附、放射免疫技术等，使犬病的研究进入了一个新的阶段。国外已有不少这方面的新的资料。例如以辣根过氧化物园酶标记葡萄球菌蛋白质A对犬自身免疫疾病、胰腺疾病的免疫组织学诊断、利用免疫学方法进行犬血型的研究等。虽然国内起步较晚，但是完全可以相信，我国在犬病研究方面必将出现一个新的局面，并在不长的时期内，迅速赶上世界先进水平。

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应用间接ELISA检测犬冠状病毒抗体*

目前检测犬冠状病毒(CCV)抗体的方法有蚀斑减数中和试验、微量血清中和试验、ELISA、间接荧光抗体技术(IFA)等［1～3］。中和试验以其敏感、特异、稳定等特点为国内外学者所公认，但中和试验所需时间长，操作复杂，不利于大规模样品的检测及基层单位使用。为此进行了本研究。

1　材料与方法

1.1　种毒与细胞　CCV NL-18参考株与CRFK细胞，引自美国，由本室殷震院士惠赠；犬肾(DK)传代细胞，由加拿大多伦多大学Compell博士惠赠；细胞生长液，为含10%新生犊牛血清的MEM培养液，维持液中不含新生犊牛血清，MEM为Sigma公司产品。

1.2　血清　CCV阳性对照血清，由本室保存，中和抗体效价为1∶500；CCV阴性对照血清，为本室保存的健康犬血清，中和抗体效价低于1∶4；待检犬血清，采自黑龙江、吉林、内蒙等地未注射CCV疫苗的犬。

1.3　包被抗原的制备　将CCV NL-18株接种于已形成单层的DK细胞，常规培养，待细胞出现病变并脱落后，将病毒培养液以3 000 r/min离心30 min，弃上清。未脱落的细胞用分散液(胰酶-EDTA混合分散液)从培养瓶中消化下来，3 000 r/min离心30 min，弃上清。将上述2 种方法获得的细胞混合物，加入0.05 mol/L碳酸盐缓冲液(NaHCO31.59 g, Na2CO3 2.93 g/L,pH9.6)，细胞计数后，保存于-20℃冰箱中。阴性抗原采用正常细胞，经消化后按上述同样方法制备。

1.4　固定条件的筛选　取阳性抗原包被酶联反应板，各反应孔中的包被量相同。选择甲醇、乙醇、10%甲醛、10%乙醇+4%冰醋酸作为固定剂分别加入到反应孔中，加入量为0.05 mL/孔。固定时间选择5 、15、30、60、120 min，以未固定的病毒抗原作为对照。同时，以阴性细胞包被反应板，取上述固定剂固定，固定时间选择30 min，以未固定的阴性细胞作为对照。测定阳性对照血清的间接ELISA结果。

1.5　阳性血清的判定标准与OD值界限的筛选　利用阳性、阴性抗原包被酶联反应板，选择中和抗体阳性、阴性血清，测定其不同稀释度的间接ELISA结果。

1.6　间接ELISA术式　将保存的病毒抗原融化，以0.05 mol/L碳酸盐缓冲液稀释，加入到酶联反应板孔内，0.05 mL/孔，吹干，每孔加入0.05 mL的固定液固定。用0.01 mol/L PBS-Tween冲洗3次，每次3 min，犬血清经PBS稀释后，加入到反应孔中，0.05 mL/孔。将反应板置于37℃恒温箱中1 h，按上述方法洗3次。再加入经PBS稀释的HRP-SPA(上海欣生公司产品，工作浓度为1∶40)，0.05 mL/孔，置37℃感作1 h，冲洗3次。加入底物溶液0.1 mL/孔。底物溶液为含50 mL 0.1 mol/L柠檬酸，50 mL 0.2 mol/L Na2HPO4，40 mg邻苯二胺(OPD)和0.015 mL 30%H2O2。常温避光显色30 min后，加入2 mol/L H2SO4，0.05 mL/孔，终止反应。利用酶联反应检测仪(上海产)在492 nm处测量反应孔的光密度(OD)。

1.7　CCV中和试验　采用固定病毒-稀释血清法。将采集的新鲜犬血液常温下放置1 h，血液充分自凝后，5 000 r/min离心30 min，过滤除菌。将血清2倍系列稀释10个稀释度，分别加入等量固定浓度为100 TCID50的病毒悬液，置37℃感作1 h后，接种于已形成良好CRFK细胞单层的培养板，每孔0.1 mL，每个稀释度加4孔，37℃吸附1 h。每孔再加维持液0.9 mL，置37℃、60%～80%湿度、5%CO2条件下继续培养4 d，以试验孔出现多核巨细胞作为未保护标准，按改进的Reed-Muench法计算血清中和效价，以中和效价不低于1∶4作为CCV抗体阳性的判定标准。

2　结果

2.1　包被抗原收获时间　利用不同时间收获的病毒作为抗原分别包被酶反应板，测定标准阳性血清的间接ELISA结果(以OD值表示，见图1)。可以看出，随着收毒时间的延长，测定的OD值逐渐升高。4 d和5 d收获的病毒抗原所测定的OD值最高。本试验在制备包被抗原时将收毒时间确定为4 d。

图1　抗原收获时间对ELISA结果的影响

2.2　抗原包被量　当包被的染毒细胞数从1.2×105/孔下降到3.0×104/孔时，阳性血清的OD值只略有下降，但是当抗原包被量从3.0×104/孔下降到3.75×103/孔时，OD值变化较大，从1.5降至0.5(图2)。故本试验将抗原包被量确定为3.0×104/孔。

图2　包被的染毒细胞数对ELISA结果的影响

2.3　固定剂与固定时间　固定的阴性抗原测得的OD值低于未固定的阴性抗原。阳性抗原经固定后，测定的OD值高于未固定的阳性抗原。甲醇和甲醛的固定效果优于乙醇和10%乙醇+4%冰醋酸。本试验将甲醇作为固定剂。在固定时间选择中可看出，固定30 min、1 h、2 h对结果无明显影响(见表1)。本试验将30 min作为固定时间。

2.4　阳性血清的判定标准与OD值界限　利用阳性抗原板测定中和试验阳性血清，20倍稀释时的OD值高于0.3；利用阴性抗原板测定中和试验阳性血清，2～10倍稀释时OD值在0.5～0.2之间，20倍稀释时OD值低于0.2。中和试验阴性血清无论用阳性和阴性抗原板测定，结果均与阳性血清利用阴性抗原板测定的结果相同。据此，以0.2作为OD值的判定界限，20倍稀释的待检血清，若其ELISA检测结果OD值高于0.2，则判定该血清为ELISA抗体阳性血清，否则为阴性血清。

2.5　间接ELISA与中和试验检测结果的比较　分别利用中和试验和间接ELISA测定35份犬血清的CCV抗体效价(图3)，血清效价以OD值高于0.2时的最高稀释倍数表示。5份中和抗体阴性血清的ELISA效价低于1∶20，30份中和抗体阳性血清的间接ELISA测定结果均为阳性。经统计学处理表明，2种方法的测定结果呈正相关(P＜0.05，r＝0.82)。

表1　不同条件下固定抗原对ELISA结果的影响OD值

图3　35份犬血清间接ELISA与中和试验结果比较

3　讨论

本试验建立了检测CCV抗体的间接ELISA方法，经初步应用证实，该方法敏感、特异、快速，可以替代中和试验进行大量的血清样品的检测。该方法以SPA作为酶标记的第2抗体，证实SPA能够与犬IgG特异结合，而HRP-SPA已经是商品化试剂，从而省略了以犬IgG免疫其他动物提纯IgG、HRP标记等繁琐步骤，有利于该方法的推广使用［4］。在操作过程中发现，包被抗原的制备、固定条件以及阳性血清的判定标准对试验结果有很大影响。

3.1　以DK细胞制备包被抗原　本试验所检测的犬主要为军、警犬和宠物犬。这些犬注射过犬用疫苗。而疫苗在生产过程中，不可避免地含有牛血清蛋白及犬细胞、猫细胞中的蛋白质成分。这些成分作为异种抗原能刺激犬体产生相应的抗体。如果利用猫肾传代细胞制备CCV抗原，则犬体内的抗体与细胞成分会发生特异性的抗原-抗体反应，虽然较病毒与相应抗CCV抗体的反应弱，但却成为间接ELISA反应中的非特异性影响因素。单纯地提纯病毒抗原，可以部分地去除细胞成分，但仍不可避免上述反应的发生。选用有病毒增殖的DK细胞作为包被抗原，可以降低非特异性反应的发生。因为犬体对于犬细胞中的蛋白成分可以产生部分免疫耐受，免疫应答反应弱，犬体产生的抗犬细胞蛋白成分的抗体量很低。在实际应用中，适当地提高阳性血清的判定标准，DK细胞与待检样品中的抗犬细胞成分的抗体虽有反应，但不至于影响最终结果的判定。因此，利用本试验方法可以检出免疫犬的抗体水平。

3.2　收毒时间　CCV接种DK细胞后，病毒增殖并释放，引起细胞病变，部分细胞变圆、脱落。据报道，单层接毒后继续培养24～36 h收获的病毒感染力最强［5］。本试验以不同时间收获的细胞作为包被抗原，对标准阳性血清测定的OD值表明，待细胞完全病变后作为包被抗原效果好。虽然收毒时间延长至4 d，早期成熟并释放的病毒感染力下降，但是其并未丧失与CCV抗体发生特异性反应的能力。收毒时间延长，病变细胞数量增多，与特异抗体的反应能力增强，包被酶联反应板时可以减少抗原的使用量，从而降低反应的非特异性。

3.3　固定条件　包被的病毒抗原经甲醇固定后，一方面可以降低非特异性反应。利用阴性抗原包被酶联反应板测定阳性对照血清的OD值，固定后的抗原所测定的结果显著低于未固定的抗原所测定的结果。甲醇作为有机溶剂，可以溶解部分脂类及蛋白成分，减少此类物质与血清中的IgG发生非特异性吸附。另一方面，可以提高与阳性血清发生特异反应的能力。CCV隶属于冠状病毒科，是单链正股RNA病毒，病毒蛋白质的合成发生于聚核蛋白体上，核衣壳的装配发生在胞浆的病毒工厂(毒浆)内，并在内质网和高尔基体的囊状膜上出芽成熟，且在此时附加囊膜突起。甲醇作为有机溶剂，可以提高细胞膜的通透性，使抗原位点暴露，增强抗原与抗体的结合能力［6］。试验中还发现，常用固定剂乙醇对CCV的固定效果不及甲醇和甲醛，其原因有待进一步探讨。

3.4　阳性血清的判定标准与OD值界限　本试验证实，间接ELISA与中和试验检测CCV抗体效价的结果具有相关性，但在中和抗体效价低的样品利用2种方法测得的结果差别较大。部分中和抗体阳性血清呈现较低的ELISA效价，部分中和抗体阴性血清的ELISA效价偏高。这一方面是非特异性反应的原因，同时也与阳性血清的判定标准有关。本试验在确定阳性标准时，选择的对照血清例数少，经统计学处理后的结果与实际标准的误差增加。另外，本试验是利用HRP标记SPA作为第2抗体参与反应，SPA与犬IgG的Fc片段结合力强，而与IgM的结合力尚未确定，中和试验却可以检测出犬感染CCV后早期IgM的变化。在实际检测时，可以适当提高阳性血清的判定标准，这样虽然可能由于阳性标准的提高而造成漏检，但却可以保证该方法的特异性。此外，如果用抗γ-球蛋白的酶标抗体代替HRP-SPA，就有可能检出低水平的抗体和感染初期的抗体［7］。OD值的界限也与间接ELISA的结果有关。以OD值0.2作为阳性界限，20倍稀释的中和抗体阴性血清有可能出现间接ELISA阴性，将0.3作为阳性界限，低效价中和抗体阳性血清又可能出现ELISA阴性，从而造成漏检。确定的标准应在扩大检测数，以及利用CCV人工感染试验查明保护犬免受CCV攻击的最低抗体水平的试验中加以探讨。

第1作者：范志强，男，1970年生，硕士，药师。现工作单位：　 沈阳军区后勤部药品检验所

作者单位:解放军农牧大学军事兽医研究所　　　　沈阳军区后勤部药品检验所范志强　夏咸柱　胡桂学　黄　耕　邹啸环　武银莲　毕森林　张治国　 *** “九五”军队医药卫生科研基金资助项目(96M118)

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犬细小病毒病病原分离与鉴定

公安部南京警犬研究所 金淮 徐汉坤 温海 王辛 宋玲华 张汇东

犬细小病毒（Canine Parvovirus，CPV）是引起犬急性出血性胃肠炎和幼犬心肌炎的主要病原。近年来，该病对养犬业造成了极大的威胁，严重地影响了我国警（军）犬事业的发展。该病毒在1977年首次由Eugster和Nairn从患腹泻的病犬粪便中分离成功。随后，在世界许多国家陆续报道了该病的流行，并分离出病毒。

自1983年开始，我们对本病进行了一系列的研究。于1986年和1987年分别从同一地区的患犬粪便中分离出两株犬细小病毒，定名为CPV—GN1和CPV—GN2毒株，并对该病毒进行了系统鉴定。现将结果报告如下：

材料和方法

一、主要试剂设备

1、细胞培养粉： MEM（日本产）、BME（美国产）、水解乳蛋白（英国产）。

2、胰蛋白酶：进口分装（美国产）

3、5一溴脱氧尿核苷（瑞典产）。

4、乙醚、氯仿等。

5、96孔微量血凝板、0.O25ml金属稀释棒、96孔细胞培养板、微量振荡器、二氧化碳培养箱等。

6、①毒株：GN1与 GN2毒株为本试验分离鉴定毒株，已传至第 15代。②对照毒株：美国 CPV74一1529毒株（CPV—A，特产研究所提供）；西德 CPV诊断液（血凝素）和猫泛白细胞减少症病毒（FPV），均由长春兽大兽医微生物教研室和南农大传染病教研室提供；貂肠炎病毒（MEV），由长春兽医大学传染病教研室提供。

7、抗血清：①抗GN1毒殊的高免血清，获自按常规免疫的家兔；②德国产抗CPV标准高免血清，由南农大兽医微生物教研室提供；③犬抗 CPV阳性血清（CPV一ch1）和豚鼠抗 CPV阳性血清（CPV一ch2），兔抗MEV阳性血清，均由长春兽医大学研究所病毒室赠送，抗FPV阳性血清，由南农大传染病教研室提供。

8、试验用细胞：CRFK、NLFK、A72细胞系西德引进，由南农大兽医微生物教研室提供。F81由中监所和长春兽医大学传染病教研室提供。MDCK、Vero、MDBK、MA104、BHK、IBRS—2细胞由长春兽医大学传染病教研室提供。

9、试验犬为 6O日龄的断乳犬，经采血样作血凝抑制试验证明，其 HI抗体滴度低于 20倍，并驱虫（口服左旋咪唑）。在攻毒前一周预先测温，采粪样（供作血凝对照）和血样供检。

10、HA缓冲液与细胞单层用 Hauk’s液:0.005M PH7.O PBS，②Hauk’s液。

二、试验方法

（一）、病毒的细胞分离培养

1、粪便标本的制备取患犬的早期粪便，以PBS作1O倍稀释，振荡数分钟以2500转／分离心15分钟，吸取上清9份，加入氯仿1份。振荡混匀后，置4摄氏度感作过夜；再以 300O转／分离心15分种，按每毫升上请加1000单位或微克的青、链霉素，4摄氏度感作两小时后，冻存，以此作为病毒分离的材料。

2、分离病毒 将接种材料按细胞培养量的 1／1O同步接种猫肾传代细胞（ GN1株）或犬肾传代细胞（ GN2株），于3 7摄氏度静置培养，并逐日观察细胞病变（CPE），历时3－5天。培养液为1O％小牛血清，维持液为2％小牛血清，培养过程中的pH值以74％NaHCO3 来校正。

（二）病毒的鉴定

1病毒的血凝（HA）特性

①血凝效价的测定 接改良的Appel等描述的方法进行HA检测。稀释液为PBS；血凝素（抗原）：细胞培养物，经冻融三次；从0.75-l％的猪红细胞悬液为 HA指示细胞。以能使0.5％红细胞凝集的样本最高稀释倍数的倒数为 HA滴度。 ②血细胞凝集谱测定 取能凝集猪红细胞的培养物作为待测样品，按表2所示方法在同样条件下与恒河猴、猪、猫、马、牛、绵羊、山羊、犬、家兔、豚鼠、地鼠、小白鼠、鸡、鹅、人一O型的0.5％红细胞进行HA试验，观察病毒液对不同种类动物红细胞的凝集特性。

2、病毒的细胞敏感谱试验

本试验选择猫肾传代细胞系（CRFK、NLFK、F8l）、犬肾传代细胞系（MDCK）、犬纤维瘤细胞系（A72）、猪肾传代细胞系（IBRS）、地鼠肾细胞系（BHK）、绿猴肾细胞系（Vero）、罗猴肾细胞系（MA104）、牛肾细胞系（MDBK）等多种细胞作为接种对象，分别接种已适应在猫肾细胞上HA滴度≥128x的第15代细胞培养液（冻融三次）。按常规方法进行同步或单层吸附接毒，37℃静置培养24小时后，换维持液（单层接毒不换液），逐日观察CPE，4－5天收获冻融，再以同样方法连传3—5代，以出现CPE和HA作为感染指标。

3、病毒的理化学特性鉴定

按Hitoshi等和殷震等描述的方法进行。以5一溴脱氧尿核苷（BUDR）代谢抑制试验检查两分离毒株的核酸型，以常规方法检查病毒对2O％乙醚和5％氯仿的敏感性，对0.5％胰蛋白酶的耐受力，以及病毒的抗酸（PH3.0）能力和耐热（56℃30分钟、80℃10－120分钟）能力。

4、病毒的形态学观察

将猫肾传代细胞培养物快速冻融三次，300O转／分离心20分钟，除去细胞碎片，取上清以2％磷钨酸盐进行负染，在J－2型电镜下进行病毒形态观察。利用含毒上清液与等量的CPV阳性高免血清混合，于37℃感作60分钟，最后用电镜载物铜网沾取病毒一血清复合物负染，在电镜下观测桥联作用。

5、病毒的交叉血凝抑制试验。

本试验在V型血凝板上进行。以稀释棒法取不同来源的血清作横排2×系列稀释。每一血清稀释两横列，一横列加 4－8单位抗原，一横列加PBS。充分振荡后, 37℃后感作一小时，最后每孔加入两滴（0.025ml／滴）PBS配制的猪红细胞悬液。充分振荡混匀后，干4℃感作2－4小时。在对照成立的情况下，以本应出现凝集组但被完全抑制的最高血清稀释度的倒数来作为HI的判定。

6、病毒交叉中和试验。

当F81在96孔细胞微量培养板上长成近7O％的单层后，取各自以4×连续横行排列稀释的免抗CPV－GNl高免血清，犬抗CPV一ch1免疫血清和豚鼠抗CPV一ch2免疫血清，统一加入等量200个TCID50的CPV一GNl培养物，37℃感作一小时后，在微量板上进行中和试验。同时设血清、病毒与健康细胞对照，于5％ CO2(37℃）培养箱中培养 5—7天，每天观察细胞病变和收毒测 HA滴度，其结果按Reed—Muench氏法计算其中和效价。

7、GN病毒株动物复归试验选择8头2月龄左右的健康幼犬，攻毒前先对其进行体温、白细胞总数、粪便HA滴度、血清中抗CPV的HI抗体水平等检查。攻毒时随机将其分为两组，一组2头，口服G N1株病毒培养液 4ml／头；另一组 6头经口接种 GN2株 8ml／头（均为15代细胞适应毒）。接种后，逐日测温以及采粪样作HA试验，于接种后的第 3和第 7天，分别采血样作白细胞计数，于接种后的第 7和第 14天分别采血样测HI效价。每组第5天分别捕杀1头犬，并对自然、人工致死的试验犬分别收集脾、心、肝、肺、肾、小肠、肠系膜淋巴结等器官的样品，置低温保存，按常规病毒分离方法处理病料，接种F81细胞上，以观察回收样品能否出现CPE现象和HA活性。

结果

（一）病毒的分离

1、 CPV—GN1株先在 F81细胞上适应二代，第一代接毒细胞无明显细胞病变，但HA效价（ 64×左右）。从第二代开始，约在接种后24—26小时出现明显的细胞病变，以细胞圆缩，胞浆收缩或聚集成网状为其主要特征，以后病变细胞呈葡萄串脱落。取其二代培养物快速冻融三次后转入CRFK细胞上进行第三代培养。

2、CPV—GN2株先在犬肾细胞上适应一代，接种细胞虽无明显CPE，但HA则为128×，第二代接种猫肾传代细胞（CRFK）在CRFK细胞上连传三代后即出现明显的细胞病变,其HA达128×以上。

3、血凝范围测定在4℃反应条件下,PBS的PH在6.0－7.4范围内，CPV一GN1株能很好地凝集猪和恒河猴红细胞，也能凝集马和猫的红细胞，而不能凝集其它动物的红细胞。在 22℃、 37℃环境中，其HA敏感性降低，在2－3小时后病毒可以RBC上解脱下来。经比较，FPV的HA活性对温度要求比较严格，其温度仅限于4℃，PH值限于6.0一6.4范围，凝集红细胞的能力以猪、恒河猴及马的红细胞最明显，不能凝集猫等其它动物的红细胞。

（二）病毒对不同细胞的敏感（细胞感染谱）试验

本试验将 GN1和 GN2两株病毒分别在1O种细胞上同步连续培养 5代，并逐代观测 CPE与HA活性。结果表明，两株毒均可在三种猫肾传代细胞（CRFK、F81、NLFK）上增殖，也可在犬纤维瘤细胞系（A72）上增殖。在MDCK细胞上，同步接种连传5代或单层吸附接种连传3代，均未发现明显的病毒增殖现象。两毒株MDCK、MA104、Vero、IBRS、BHK等细胞上既无CPE，其培养液亦无HA活性。

（三）病毒的理化学特性

两分离毒株的理化学特性试验结果表明，BUDR能抑制GN1和GN2毒株的增殖，证明分离毒的核酸是DNA型。两毒株都能抵抗20％乙醚4℃24小时、5％氯仿4℃1O分钟、PH3．0 37℃2小时和0.5％胰蛋白37℃1小时处理。也能抵抗56℃30分钟、80℃1O分钟的高温处理；80℃10—3O分钟病毒部分失活，80℃6O分钟内病毒全部失活。

（四）病毒的形态观察结果

将病毒悬液敷子铜网上，经2％磷钨酸负染镜检，在1个视野见有散在的病毒颗粒。在此基础上又进行了免疫电镜观察（即在病毒液中加等量的抗 CPV免疫血清,37℃ 6 O分钟后将样品沾于铜网上，磷钨酸负染），在电镜下均可．见到凝集成团的桥联现象，病毒颗粒大小均一。病毒颗粒有电子密度相差悬殊的空心和实心两种形态存在。多为圆形，无囊膜，直径约20－22毫微米。

（五）病毒的单相交叉中和试验

用已知的犬抗 CPV－Chl（长春株）和豚鼠抗 CPV— Ch2株，以及免抗 CPV— GN1株的血清与 100个TCID50的 CPV－ GNl进行单相交叉中和试验。结果按 Reed－Muench氏法计算表明，三种血清都能与 CPV－ GNl株病毒产生中和反应；中和效价均为1:256。

（六）病毒的交叉血凝抑制试验

用已知的cpv抗血清（抗cpv－G西德株、犬抗cpv－CN和豚鼠抗cpv—Ch2），同时对GN和GN2（4一8单位）分离毒株进行 HI试验。并以免抗 CPV－GNl株免疫血清与美国标准毒株（CPV－A）做交叉血凝抑制试验。为比较分离毒株与 FPV、MEV抗原关系，试验中还将分离毒与抗 FPV血清、抗 MEV血清进行交叉 HI试验。结果表明：CPV—GN1株与本源抗血清 HI效价为 1280×，同源美国、西德标准毒株和国内毒株的HI效价为640—1280×，相差1个滴度以内。而与异源毒株（FPV、MEV）交叉HI效价为80－320×，相差4个滴度以上。

（七）病毒的动物回归试验

以GN1口服接种2头小犬，GN2口服接种6头小犬，试验接毒后的临床观察以及粪便、血清、白细胞检测结果详见表6。结果表明：两毒株在接种后2一7天，试验犬陆续表现短暂的温和型临床症状。接种后第2天有1头犬出现严重的呕吐，大便带血，体温升高（40.3℃），食欲废绝，精神沉郁，在接种后第3天死亡。病理解剖发现小肠出血，粘膜脱落，肠系膜淋巴结肿胀、出血；肠腔内有血样粪便。两毒株接毒后 3天， 4／7的犬白细胞减少且临床症状基本消失, 2—14天，粪便中均有病毒排出。接种后7天,HI效价平均为 320×；到第 14天升达 64O－1280×。

于接种后5天，取自然死亡犬和捕杀抽验的两头犬（每组1头）的脾、肾、肠系膜淋巴结、小肠等脏器，研磨制成10×乳悬液，冻融数次后离心，取上清接种F81细胞，均成功地分离到病毒。在接种后的2—5天收集的粪便中也分离出病毒。

讨论

一、关于GN病毒株的一般性状

本课题从患出血性肠炎病犬粪便中分得CPV一GNl和CPV－GN2两毒株，经生物学特性和理化特性鉴定，与国内外描述的CPV基本一致。证实我们分离的两株病毒属于小DNA病毒科、细小病毒属的成员之一。

关于CPV对MDCK细胞的敏感性,Siegl和Maehgub的研究认为，各种MDCK细胞株对CPV的感染性有一定差异。据报道，有的毒株在某些MDCK细胞株上（C株）呈钝感甚至不增殖。本试验发现，病毒在MDCK细胞上，无论是同步接种速传5代或单层接种连传三代，均未见有病毒的增殖和细胞病变。对此我们分析有以下几种可能；①所用的MDCK细胞株对CPV缺乏易感性；②病毒在MDCK细胞上的传代代次偏低；③分离毒株在培养和细胞适应过程中交叉培养史不同。从实验程序来看，我们分离的毒株因在猫肾细胞上已适应15代，待转到MDCK细胞上，初始几代培养中暂不适应；④病毒毒株间的差异，如同Eugstev（1980）、Appel （1979）等报道的CPV对Vero细胞敏感性不一样，GN病毒本身就对MDCK细胞缺乏易感性。上述推测，尚待进一步研究证实。

二、分离毒株与已知毒株，以及FPV、NEV之间的血清学关系

在本试验中，交叉血凝抑制试验的结果表明，两分离毒株均能与 FPV、MEV产生交叉 HI反应，但 3种病毒的抗血清与同源病毒反应测得的HI效价，比与异源病毒反应测得的HI效价，高4个滴度以上，这些结果不仅证明两分离每株与其他学者报道的CPV结果一致，与FPV、MEV有相关的抗原性；而且也说明3种病毒抗原与抗体的亲和性以同源为高；这种亲和性与制备抗体的动物种类可能无关。

三、关于细小病毒的致病性

许多学者认为:CPV人工感染犬只引起温和型临床变化。在本试验中，以两株分离病毒人工感染8头犬后，仅有1头在接种后2天出现典型的临床症状，并于第3天死亡。其它7头犬仅表现短暂的温和型症状，且于第7天恢复正常。从自然死亡犬和在第5天捕杀犬的脏器中，以及从接种病毒后第2－5天的粪便中，均回收到了细小病毒。以上结果与国外报道相似。与此相比较，以病料（自然感染犬的脏器和粪便提取物）回归动物，可导致与自然感染相类似的临床症状。故在一些CPV疫苗效力试验中，多使用自然病犬含毒脏器悬液作为试验动物的攻毒材料。